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标题:【求助】Real time PCR内参CT值奇高!

bring[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Real time PCR内参CT值奇高!


小弟刚入手荧光定量PCR,原理不是怎么清楚,糊里糊涂就做上去了.取的动物全血,200微升左右抽提,使用的是invitrogen的trzol.RNA抽提完没有DNA酶消化,直接RT,然后real time PCR检测基因表达的改变,RT 和real time PCR 的kit都是TAKARA,PCR结果让我更是糊里糊涂,内参的CT值(30~33)竟然比所有的基因ct值(28~32)都高,不知道什么原因,也不知道哪步出错了.荧光定量PCR完我把所有的孔拿回来跑普通的电泳,内参的条带比其它所有的基因都亮,怎么回事呢?请哪位高手指点一下,不知我有没有表达清楚?
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yayya[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的目的基因的荧光值也很高了，建议你把模板稀释了以后再做一次。
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发表于 2015-12-4 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yayya 于 2015-12-4 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的目的基因的荧光值也很高了，建议你把模板稀释了以后再做一次。

模板稀释后CT值不是更高了吗?不是太清楚,请哪位高手指教一下啊!!!小弟今年毕业,就是这一关过不去,再次感谢啊!!!
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49888[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况也许很正常啊
极可能是你目的基因的量在你的样品之中没有你的内参的量高，但这并不妨碍你做数据分析。
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发表于 2015-12-4 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 49888 于 2015-12-4 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种情况也许很正常啊
极可能是你目的基因的量在你的样品之中没有你的内参的量高，但这并不妨碍你做数据分析。

如果目的基因的量没有内参的量高,应该是Ct值比后者高啊,我的结果与此相反,是不是我的RT效率太差了,还是不懂DisapprovedDisapproved
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yayya[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的内参的片段大小是多少，realtime要求是300bp一下，而普通的pcr一般较大，可能造成差异
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yizhi[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、再看一下溶解曲线，哪个峰更高点，有时候电泳条带亮度并不可信，因为电泳跟你的操作有关。
2、既然你所有的CT值都那么高，说明你的CDNA浓度很低很低（比较的意义不大）下次提高模板量再看看。
3、还有个不是疑问的疑问，是同一管的CDNA，不同引物比较的CT值么，如果不是，那就没什么好说的了。
4、如果不是同管CDNA，那么你所说的比较就似乎可以理解了。因为CT值比的是起始CDNA浓度，电泳检测是循环后CDNA表达浓度。
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发表于 2015-12-4 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的内参的片段大小是多少，realtime要求是300bp一下，而普通的pcr一般较大，可能造成差异

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我内参片段是170bp左右,我跑的普通PCR也是Real time PCR 体系,我也把Real time PCR的扩增长物拿回来跑电泳的.
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发表于 2015-12-4 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、再看一下溶解曲线，哪个峰更高点，有时候电泳条带亮度并不可信，因为电泳跟你的操作有关。

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溶解曲线还是内参的峰高.电泳我们用的是染料,加在胶里的.上样我都是10微升的体系。
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发表于 2015-12-4 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2、既然你所有的CT值都那么高，说明你的CDNA浓度很低很低（比较的意义不大）下次提高模板量再看看。

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可能是,但是我的样品没有了,每个动物只取了100微升血抽RNA,其它都做别的检测.请问"比较意义不大",是不是我的样品都没用了?
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