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标题:【求助】凝胶层析图谱问题

大花猫bb[使用道具]
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发表于 2015-12-4 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】凝胶层析图谱问题

我是做蛋白质纯化的，第一次装柱就跑凝胶，结果有3个气泡，没有发现，跑了一次后，出了2个峰。后来重新装柱，结果发现少了一个峰，原来那个小峰的地方变成一个很小的突起。但是两次上样的量是一样的。
我两次出峰的时间都比较短，大约是走了0.5个柱子体积就出第一个峰，第二个峰大约是0.7-0.8个柱体积就出峰了。
而我的蛋白质条带大约在60KD以下的为主，用的是进口的S-200
各位大侠觉得我是哪里出问题了？
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yayayu[使用道具]
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发表于 2015-12-4 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

3张图的时间顺序就是这样。第1张是有气泡的柱子跑的。第3张加样量加大了0.5倍，好像大峰的右边是不是还有一个小峰，没有分开？丢掉的小峰就是第1张中的第1个峰
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无怨无悔[使用道具]
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发表于 2015-12-4 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我已经看过图了，60KD的蛋白质属于S200的分离范围，肯定会在一个柱床体积内出来的。既然蛋白质是多个，那么无论是一个还是2个峰都是没用的，都得不到纯的单条带组分的，换别的分离方法吧。
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yayayu[使用道具]
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发表于 2015-12-4 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

而且这条A280基线跳动得太剧烈了，机器有问题，可能是光源。
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malong[使用道具]
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发表于 2015-12-4 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

因为我的电压值很小，别人的大多在100以上 我的只有在1以下，所以很麻烦。我用+1至 -1 的范围内做色谱图，结果峰不是很大，但时看不到这个右边的小峰 只有到了你看到的这个范围 才能看到那个小峰。 所以此时的基线变得很不稳。 如果+10 至-1的范围 基线就很直了！！我唯一想不通的是，柱子中有气泡竞会多出了一个峰，难道有气泡的分辩率会更好？
还有一个更奇怪的，分子筛过完后，纯化倍数下降了，酶与蛋白浓度的比值竞变小了？
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发表于 2015-12-4 17:38 资料  个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

分子筛会不会特异性吸附淀粉酶啊？
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发表于 2015-12-4 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

空气是会产生紫外吸收的，会有一点气泡随着流动相出来引起A280波动。
淀粉酶是酶，上样前可能有些离子促进酶活力，除去之后自然就下降了。之前的比活力可能是假象，现在才是真相。
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发表于 2015-12-4 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

但是重装后 原来有小峰的地方 是一个很小的突起。同时我想问的是分子筛是不是会吸附一些离子啊？我上样的时候用的是PH5.0缓冲液+0.15摩尔每升的氯化钠 应该会避免分子筛的吸附吧
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发表于 2015-12-4 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

分子筛会脱盐，使蛋白质样品里原本含有的盐与蛋白质分开，不知道会不会吸附离子。
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发表于 2015-12-4 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我的分子筛的柱子只有45厘米高，会不会这个长度造成了我的分子筛效果不好。我跑电泳时，离子胶处理后的条带与分子筛处理后的结果没有差别。我的目标大约在60 而有大量的杂蛋白在10-30左右。这怎么会分不开呢？难道是我的分部收集管污染了？
我的管子是用水煮沸10分钟，用自来水洗后，再用蒸馏水洗净后烘干。管子上的塞子只是洗净没有煮沸灭菌 这样会影响吗？电泳的枪头全是灭过菌的？
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