【求助】PI染色的步骤

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标题:【求助】PI染色的步骤

flower@@[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想进行细胞周期的检测，请教大家PI染色的步骤方法,购买PI时还需其他的试剂吗?谢谢急!

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Staining Procedure
1. Prepare 10-50 µM PI solution with PBS or an appropriate buffer.a)
2. Add PI solution with 1/10 of the volume of cell culture medium to the cell culture.b)
3. Incubate the cell at 37 ºC for 10-20 min.
4. Wash cells twice with PBS or an appropriate buffer.
5. Observe the cells using a fluorescence microscope with 535 nm excitation and 615 nm emission filters.
a) Since PI may be carcinogenic, extreme care is necessary during handling.
b) Or you may replace the culture medium with 1/10 concentration of EB buffer solution.

SO2[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这种方法不是最好的，PI直接加到含培养基的细胞内造成大量的非特异性染色，染色温度也不对，37度不如4度。以上方法似乎不是用来做流式的，而是做荧光显微成像的，注意别人的请求是做流式的。详细的步骤哪位达人补充一下？实验当中，没时间发。

c86v[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[试剂及配制］
(1)碘化丙啶（PI）染色液（４摄氏度避光保存）：PI 100ug/ml,Triton-X 100 1.0%,NaCl 0.9%
(2)RNase A 1mg/ml
(3)预冷70%乙醇
(4)0.01mol/L PBS,PH7.2
[荧光染色]
(1)制备的单细胞悬液可用70%乙醇固定,4摄氏度保存.
(2)染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液.
(3)加20ulRNase A 37摄氏度水浴30分钟.
(4)再加入800ul PI染色液混匀,至4摄氏度避光30分钟.
(5)用流式细胞仪进行测试.记录激发波长488nm处的红色荧光.
[结果判断]
细胞凋亡时,DNA直方图上凋亡细胞出现二倍体峰(G1)细胞减少,G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型;在光散射图谱上,出现低于正常FSC和高于正常的SSC.

ending[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

跑flow重點不是pi..是其他的步驟
10 cm dish 細胞收集在15ml的falcon tube, 加0.5 ml pbs resuspend , 在votex上慢慢加 ice-alcohol, 開始加時最好一滴滴的, 而且要一直votex , 這樣細胞就會分散得很好,最後放在冰箱, 至少隔一天,之後什麼時拿出來用都可以了. 加酒精時會有一些白色東東,是一些變性的蛋白,不用理他
要跑flow時拿出來離心, 用pbs wash 3次, 最後一次加rnase,離心後加pi , 避光半小時後過濾 (bd公司的一種cap filter,用後清洗可重覆使用),之後上機.

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也想用PI染细胞,不知道该用什么样的浓度和方法?!

3.14[使用道具]
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发表于 2015-12-11 11:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

和分子克隆一样经典的书，细胞实验指南上有两种方法。只要买PI就可以了

seagate[使用道具]
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