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标题:【讨论帖】成熟脂肪细胞、脂肪干细胞交流

purrr[使用道具]
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【讨论帖】成熟脂肪细胞、脂肪干细胞交流

额最近一直在养脂肪干细胞,整理了些资料,与大家分享下。也希望就这一块,与各路大侠们多交流交流经验!!
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purrr[使用道具]
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人来源脂肪干细胞的培养
1.脂肪干细胞原代培养
取约500mg脂肪组织(自外科手术患者的皮下获取),再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中,每个离心管中的组织不超过5ml。
吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中,用吸管吹打10~20次,然后静置1min左右,用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状,不带有血细胞为止;
向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液(胰酶0.25%,I型胶原酶0.1%,以1:1比例混合配制而成),将试管密封,放入37°C恒温摇床中,190r/min,震荡消化30min。此时液面分为3层,上层为黄色油状脂肪细胞层,中层为脂肪组织层,下层为含单个核细胞的液体;
吸出离心管中的下层液体过200目滤网到含完全培养基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)的新离心管中终止消化,然后将离心管封闭,1500rpm离心10min;
用吸管吸取上清后去掉,加入1ml 培养基,轻轻吹打10~20次制成细胞悬液,将各个离心管中的细胞悬液收集起来,接种待用;
在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶,重复以上步骤继续消化,重复2-3次,将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中,放入37°C、5% CO2培养箱培养;
第一次换液:大约12-24小时后,观察细胞贴壁即可进行第一次换液,此后每隔3天换液,待细胞生长至融合后进行传代。
2. 脂肪干细胞传代培养
在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基,加PBS冲洗2-3次,之后加入1-2mL消化液(0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1));
培养箱内进行消化(3-5min),倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化,当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩,细胞间隙不断增大,细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时,加入等体积的培养基终止消化;
用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞(动作要轻柔,注意不要产生气泡),使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液;
将单细胞悬液移至离心管中,离心,(1000rpm,5min),弃上清,加入完全培养基,轻吹使之松散,按1:2传代培养;
显微镜下逐日观察传代培养的细胞,待贴壁细胞达到90% 以上融合时,再进行传代,如此反复。
3. 脂肪干细胞的冻存
将传代培养的细胞悬液以1×106cells/ml的比例加入预冷冻存液(含5% DMSO,30%胎牛血清的DMEM),充分混匀后置预冷的冻存管中。将冻存管置于-80°C低温冰箱中过夜后,投入液氮中保存。
4. 脂肪干细胞的复苏
取出液氮中的冻存管,迅速投入37°C水浴中快速晃动,直至冻存液完全溶解,复温在1-2分钟内完成;
用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染;
无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中,补加4ml培养基后离心(1000r/min, 5min),弃上清;
收集细胞,用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中,于37°C, 5%CO2培养箱中培养。
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成熟脂肪细胞的油红O染色
原理:利用染料易溶于脂质的性质证明组织脂质含量的多少
染料的配制:油红O 0.5g 溶于100ml异丙醇
染色步骤:
1,稀释,染料同蒸馏水按3:2稀释
2,过滤,通过定性滤纸过滤,没有滤纸的话,可以用口罩过滤;
3,固定,吸弃培养液后加入固定液5min.9 `: G( {1 V. E; P/ P4 Q, y- S
4,吸弃固定液,加入染色液15min后水洗一次镜检观察。
5,苏木晶复染
6,水冲洗至变蓝。观察。
注:5,6两步可选择性省去。
注意事项:
1、过滤要有保障,不然染色后观察时杂质很多。8 ^3 U' u4 q6 R2 H2 n8 k3 u
2、要注意配好的油红O工作液要在2个小时内用,不能放置时间过长。" a" e( A3 ^* b
3、苏木精复染可以使细胞形态更清晰,拍出来的照片效果也会更好。苏木素复染时间不能过长- m( L0 I* c8 H/ m' e/ u2 ^
4、 染色结果不能长期保存,应尽快观察及照相。
5、油红O染脂滴是很容易的,如果没有染上,那就可能不是脂滴而是空泡。
附件中为此内容word版本,另附染色效果较好的照片
欢迎大家指正!!
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xuuuu[使用道具]
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不知如何鉴定为脂肪干细胞?
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purrr[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 xuuuu 于 2015-12-11 11:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知如何鉴定为脂肪干细胞?

一般有三种方法:
1,细胞形态鉴定。脂肪干细胞培养48小时后大多数贴壁,并开始伸展、分裂,呈梭形,有粗大突起。
2,细胞表面特异标志物鉴定。
3,细胞成脂能力诱导鉴定。
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ADSC没特异性的表面标记物,是否用干细胞的标记物去验证?你做过这方面的验证吗?
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bojitu[使用道具]
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比较有用,我现在研究骨髓间充质干细胞,不知哪位大侠提供一些这方面的资料。谢谢了!
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Darcy[使用道具]
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ADSC没特异性的表面标记物,是否用干细胞的标记物去验证?你做过这方面的验证吗?

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我们实验室有做过,具体你可参考我分享的那篇文献!
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sunnyB[使用道具]
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你好,我最近也在做原代脂肪干细胞的培养,但是发现多角形细胞比较多,中间夹杂着呈梭形的脂肪干细胞(像文献中脂肪干的形态),没有出现那种都是梭形而且呈旋涡状分布的情况,想请教下lz,可能的原因是什么呢?
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purrr[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 sunnyB 于 2015-12-11 11:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好,我最近也在做原代脂肪干细胞的培养,但是发现多角形细胞比较多,中间夹杂着呈梭形的脂肪干细胞(像文献中脂肪干的形态),没有出现那种都是梭形而且呈旋涡状分布的情况,想请教下lz,可能的原因是什么呢? ...

据我观察,也不是所有的脂肪干细胞都呈梭形,有些就是多角形。呈漩涡状分布的话,一般是细胞密的时候呈现,此时细胞状态应该也是很好的。
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