小中大
这个得根据你的实验设计 是要看多长时间的毒性。因为ROS的产生有时间变化 ，得在那个时间内做才可以，如 有的在放入药物几分中就产生明显的变化，那就在荧光抚育以后加入药物
如果是加入药物几个小时以后观察变化，则要后用荧光抚育
这个是我实验的方法
1、 实验前将DCFH-DA荧光试剂用DMSO配成20MMOL/L,低温避光保存
2、 将细胞接种于24孔板，1ml/孔，3*105/ml, 培养板放入37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24小时.
3、
4、 24小时后,抽出培养液,PBS洗两次,每次5分钟,加入药物，
5、 孵育完毕后取出细胞, PBS洗细胞两次，每次5分钟，
6、 将荧光试剂用无血清培养基稀释成终浓度50umol/l，每孔加入1ml，37℃,，95％ O2, 5%CO2, 孵箱孵育1小时。
7、 吸出含荧光试剂的培养基,用0.25％胰酶消化细胞，当细胞脱落时加入含血清培养基中止消化，将细胞吸入玻璃管，离心，1000rpm， 5min, 用PBS洗三次,离心,1000rpm,5min.
8、 流式细胞检测，激发光488 发射光 525 ，至少检测5000个细胞。
