小中大【求助】线粒体mitotracker染色
我先说说我的细节，哪位好心人来帮我看看需要改进的地方
1.取mitotracker deep red633（WM:543.58）一小包50微克，用DMSO配的1mM的储存液。
2.细胞爬片后，PBS洗10min,用含血清的DMEM培养基按500nM（即1：20），300nM，250nM，200nM，100nM稀释储存液，7度染30min，然后吸掉培养液换新的培养液，37度放10min后吸掉。甘油封片置于镜下观察。
3.细胞爬片后，PBS洗2*10min，多聚甲醛固定10min，Trixon-100透化10min。用PBS将储存液稀释成500nM（即1：20），300nM，250nM，200nM，150nM,100nM，滴加于玻片上。室温作用25min。PBSPBS洗2*10min。甘油封片，观察。
我的结果是这样的。活细胞和固定后细胞染色，500nM和300nM均出现红色荧光。
活细胞染色，250nM有荧光，大致能分出单个细胞轮廓。200nM只能在整个玻片看见模糊的一片红色，分不出细胞轮廓。100时几乎看不见红色荧光。
固定后的细胞，250有很可靠的红色荧光；200也可以，可见细胞轮廓；150时也有荧光；100时什么都没有。
我的问题：
1.我在一般的荧光显微镜下无法看到产品光告图中线粒体都是丝状和棒状的。用什么镜子能看到？
2.我要做的是双染，还要用免疫荧光染一下细胞膜，请问用活细胞染线粒体之后固定在做免疫荧光和先固定再染线粒体，之后免疫荧光，这两者哪一个更好？
3.关于线粒体工作液的浓度，普通荧光显微镜下的结果有多大的可信度呢?就是说普通镜下看倒的模糊荧光，是不是在共聚焦下能清晰些？
4.甘油封片后，我的玻片上总是在很短的时间内出现像结晶一样的物质，放PBS里洗一下，就没有了，过一会，玻片稍干燥，就又出现了结晶。我想问有谁碰到过这种情况吗？
非常期待你有空的时候伸出你援助的手，我真的很感激 ！
