生物质谱 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】免疫沉淀的方法分离目的蛋白的可能互作蛋白

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】免疫沉淀的方法分离目的蛋白的可能互作蛋白

n111[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 129714
精华 0
积分 2860
帖子 1620
信誉分 100
可用分 9726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-12-17
状态 离线
1

发表于 2015-12-16 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫沉淀的方法分离目的蛋白的可能互作蛋白

如题，想通过免疫沉淀的方法分离目的蛋白的可能互作蛋白，通过SDS-PAGE电泳后考兰染色，切下条带后送公司质谱分析，鉴定可能的互作蛋白。
在切胶的时候，需要每个条带都切成一个样品送鉴定吗？之前做磷酸化位点鉴定的质谱分析时，相同的实验步骤看似条带很单一的一个条带回报出了近30个蛋白，那么在做互作蛋白切胶的时候，是不是不用非常严格的按照单一条带来切呀？大概分下区就送过去是不是可行呢？如果可行还能省点钱！：）
请有经验的战友帮着看看！
顶部
哈密瓜[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128271
精华 0
积分 2135
帖子 1149
信誉分 100
可用分 7083
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-10-28
状态 离线
2

发表于 2015-12-16 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

可以的啊，。看你用什么仪器，扫描速度快的仪器，你分几份就可以了！ IP之后的蛋白数量应该不会很多的！不过你这个实验最好有三个重复。
顶部
aaby[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 127161
精华 0
积分 2602
帖子 1423
信誉分 100
可用分 8733
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-9-14
来自 内蒙古乌兰察布市集宁
状态 离线
3

发表于 2015-12-16 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 QQ

 小中大

【回复】

有按差异条带切 这样相互作用强 为鉴定省事
但容易忽略重要 没有显带的相互作用蛋白

或按marker 依次全部切
这样不会遗漏
但鉴定时工作量大

建议结合起来
顶部
zouyou[使用道具]
一星
Rank: 6Rank: 6


UID 128420
精华 1
积分 3167
帖子 1809
信誉分 102
可用分 10670
专家分 10
阅读权限 255
注册 2014-11-1
状态 离线
4

发表于 2015-12-16 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

看到了，谢谢两位战友！但不知道质谱分析一次最多能扫出多少蛋白呀？不会因为蛋白太多影响了效果吗？
顶部
跳跳哈里[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128275
精华 0
积分 1920
帖子 999
信誉分 100
可用分 6341
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-10-28
状态 离线
5

发表于 2015-12-16 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

您好，我现在在做用质谱分析检测蛋白的磷酸化位点。我用IP的方法把目的蛋白富集后，跑胶染色也是可以看到很单一的一个目的条带，但是送去做质谱分析竟然检测到了100多种蛋白质，而且结果显示我的目的蛋白上没有磷酸化修饰的位点。明明我的目的蛋白在正常情况下就是一个有磷酸化修饰的蛋白。所以，我想问问你前期富集目的蛋白的方法是什么？有进一步富集磷酸化肽段吗？我的目的蛋白在细胞中的表达量挺高的，所以我富集的是内源性的目的蛋白，需要转染过表达目的蛋白吗？期待您的回复！谢谢！
顶部
妮子@[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128300
精华 0
积分 2457
帖子 1334
信誉分 100
可用分 8201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-10-29
状态 离线
6

发表于 2015-12-16 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

磷酸化肽段富集可以采用二氧化钛（Tio2）富集，你如果是有磷酸肽段而没有检测到，有可能是你的磷酸化位点在整个蛋白中的覆盖率太低，因此最好富集磷酸化肽段再做质谱分析，我的联系方式1 3 774472718，如有问题可以联系我。谢谢
顶部
wawa11[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 131733
精华 1
积分 2168
帖子 1191
信誉分 102
可用分 7324
专家分 10
阅读权限 255
注册 2015-2-4
状态 离线
7

发表于 2015-12-16 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

没有专门针对磷酸化肽段进行富集，内源性表达高不用一定要过表达目的蛋白吧！
顶部
冰激凌[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128430
精华 0
积分 2798
帖子 1535
信誉分 100
可用分 9020
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-11-2
状态 离线
8

发表于 2015-12-16 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

你看下你蛋白的序列，有可能你的修饰位点在一个很小的肽段上，搜库的时候给排除了，一般来说搜库时小于7个氨基酸的肽段是排除的
顶部
跳跳哈里[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128275
精华 0
积分 1920
帖子 999
信誉分 100
可用分 6341
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-10-28
状态 离线
9

发表于 2015-12-16 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我自己整理的质谱数据分析的课件，按照研究问题进行了分类介绍。
顶部
冰激凌[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 128430
精华 0
积分 2798
帖子 1535
信誉分 100
可用分 9020
专家分 0
阅读权限 255
注册 2014-11-2
状态 离线
10

发表于 2015-12-16 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

看到这样的课件很不错，支持一下。
可惜国内的蛋白质组学研究明显滞后于基因组学丫。难道是质谱太贵了？感觉也没比测序仪贵多少吧。
顶部
 12  1/2 12››