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标题:跪求各位高手，PCR已做了一个月但是没结果

blueeye[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跪求各位高手，PCR已做了一个月但是没结果

跪求各位高手，PCR已做了一个月但是没结果


我要得到的目的片段的序列如下：
1: BD073420. Utilization of tr...[gi:22619023]
OCUS BD073420 1266 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002
DEFINITION Utilization of transcription factor Brn-3a.
ACCESSION BD073420
VERSION BD073420.1 GI:22619023
KEYWORDS JP 2001511344-A/2.
SOURCE Mus musculus (house mouse)
ORGANISM Mus musculus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1266)
AUTHORS Damien,S.M. and Seymar,L.D.
TITLE Utilization of transcription factor Brn-3a
JOURNAL Patent: JP 2001511344-A 2 14-AUG-2001;
NEUROVEX LTD
COMMENT OS Mus musculus (mouse)
PN JP 2001511344-A/2
PD 14-AUG-2001
PF 27-JUL-1998 JP 2000504246
PR 25-JUL-1997 GB 9715823.2,10-DEC-1997 US 08/988476 PI
SMITH MARTIN DAMIEN,LATCHMAN DAVID SEYMAR
PC C12N15/09,A61K38/17,A61K39/245,A61K48/00,A61P25/00,C07K14/47,
PC C12N7/00,
PC C12N15/00,A61K37/12
CC Utilization of transcription factor Brn-3a
FH Key Location/Qualifiers
FT CDS (1)..(1266).
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1266
/organism="Mus musculus"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:10090"
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blueeye[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ORIGIN
1 atgatgtcca tgaacagcaa gcagcctcac tttgccatgc atcccaccct ccctgagcac
61 aagtacccgt cgctgcactc cagctccgag gccatccggc gggcctgcct gcccacgccg
121 ccgctgcaga gcaacctctt cgccagcctg gacgagacgc tgctggcgcg ggccgaggcg
181 ctggcggccg tggacatcgc ggtgtcccag ggcaagagcc accctttcaa gccggacgcc
241 acgtaccaca cgatgaatag cgtgccctgc acgtccacgt ccaccgtgcc gctggcgcac
301 caccaccacc accaccacca ccaccaggcg ctcgagcccg gtgacctgct ggaccacatc
361 tcgtcgccgt cgctcgcgct catggccggc gcagggggcg caggcgcggc gggaggcggc
421 ggcggcgccc acgacggccc cgggggcgga ggcggaccgg ggggcggcgg tggcccgggc
481 ggcggcggcc ccgggggtgg cggcggcggc ggcggcccgg ggggcggcgg cggcgccccg
541 ggcggcgggc tcttgggcgg ctcggcgcat ccgcacccgc acatgcacgg cctgggccac
601 ctgtcgcacc ccgcggcggc ggcggccatg aacatgccgt ccgggctgcc gcatcccggg
661 ctcgtggccg cggcggcgca ccacggcgcg gcggcggcag cggcggcggc ggcggcgggg
721 caggtggcgg cggcgtcggc cgcggcggcg gtggtgggcg cggcgggcct ggcgtccatc
781 tgcgactcgg acacggaccc gcgcgagctc gaggcgttcg ccgagcgctt caagcagcgg
841 cgcatcaagc tgggcgtgac gcaggccgac gtgggctcgg cgctggccaa cctcaagatc
901 ccgggcgtgg gctcgctcag ccagagcacc atctgcaggt tcgagtcgct cacgctctcg
961 cacaacaaca tgatcgcgct caagcccatc ctgcaggcgt ggctggagga ggccgagggc
1021 gcgcagcgtg agaaaatgaa caagccggag ctcttcaacg gcggcgagaa gaagcgcaag
1081 cggacttcca tcgccgcgcc cgagaagcgc tccctcgagg cctattttgc cgtacaaccc
1141 cggccctcgt ctgagaagat cgccgccatc gccgagaaac tggacctcaa aaagaacgtg
1201 gtgcgggtgt ggttttgcaa ccagagacag aagcagaagc ggatgaaatt ctctgccact
1261 tactga
//
已经定了三对引物，其中有一对是文献报道的，结果都一样没有，没有，还是没有。小弟现在陷入极度苦闷，真是生不如死，老板还在后面猛催，

跪请各位高手赐教，帮助设计引物，或是出谋划策均可，呈上十二分感谢。
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发表于 2011-10-4 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你要扩增片段还是整个基因全长？如果是全长就只能用开始和结束的碱基作为引物，你可以将引物长度调整到20-25BP之间，可能会提高特异性。另外根据你描述的没有，没有还是没有，呵呵，是不是啥都扩不出来？这种情况要考虑你的模版是不是有问题。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很抱歉你没有很好的说明你的情况 恐怕爱莫能助。楼上关于模板的问题你应该好好考虑一下。
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森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计是你模板的问题
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发表于 2011-10-4 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你没有很好说明你的情况,也没有说明你做了哪些尝试,真是不好解答.丁香园是个很好的网站,关于PCR的讨论实在是太多了.建议你多浏览一下该栏目.
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=37662&sty=1&tpg=1&age=0')
也许你的问题不需要别人再做解答,就可以迎刃而解.
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8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
绝对事模板的问题！！
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-10-4 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这段DNA的GC含量比较高，有点难度，你可以试一下这一对引物。

5'-ATCGCGGTGTCCCAGGGCAAGA-3'

5'-GGTCCGTGTCCGAGTCGCAGAT-3'

长度为604bp。做64度退火。或做68度的touchdownPCR，应该会有结果。
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blueeye[使用道具]
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 小中大
一点结果没有，先引物比对看有无问题。然后用标准kit，看系统有无工作，自己配的东西很不稳定的
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 小中大
比较一下其保守序列，引物设计不要在内含子里。
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