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标题:请教：RNA提取和RT－PCR

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：RNA提取和RT－PCR

请教：RNA提取和RT－PCR [转载]


我做了组织的RNA提取，过程很顺利，测OD值260nm/280nm=2.4，做RT－PCR，然后跑电泳，结果除了引物二聚体和RT－PCR试剂盒自带的阳性对照以外，没有β－actin出现，也没有目标产物的出现。请问结果怎么解释？
谢谢各位大侠！
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=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
出现这种情况的原因很多
首先,RNA是否降解,因为你的actin都没有出来；是否反转成功了你想要的cDNA,RNA不能说明问题，因为还要反转录，这个过程中也要防止RNA的降解，建议你的RNA跑一个电泳，看有没带出现。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的内对照β－actin都没有出现PCR产物。可见你以前每个环节包括RNA抽提,RT,PCR都有可能有问题。
我的建议是:
1.所有要用的器具都严格用0.1%DEPC处理.
2.从RNA抽提,到RT,到PCR要一路做下来,别停,甚至可以不用测CD,更何况说RNA电泳.就是其他的战友说的那样要速战速决.RNA电泳看起来降解了,很多时候也可以作出RT-PCR的.
3.有时要注意PCR的条件，可以用一个带有目的片段的质粒DNA作PCR的阳性对照。
总之，RT-PCR要保证3个环节的成功,即RNA抽提,逆转录和PCR.如果你这3个过程都设计好阴\阳性对照,问题就很容易找出来了.而且，等你做出结果后，你就成为RT-PCR高手了.  
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RT我已经做了7年了。成功率现在为100％。现在建议如下：
1 一次性的耗材如果包装完整，没有必要进行灭RNA酶的处理。
2 楼上的朋友说的很对，速战速决很重要。
3 不要太担心RNA降解，尽量减少将标本置于37度左右温度环境。
4 RT过程中的RNA的变性很重要，置于冰水中的速度要快。其作用为打开RNA的二级结构。
5 PCR的反应条件很重要。如果上下游引物的TM值相差较远，可用touchdown的方法来做。
6 从你说的情况来看，RNA的降解并不是主要问题。
7 如果仍有问题，可将实验过程描述详细一点，我将尽快回答。
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,鉴于你做RT很有经验,我想请问一下,如果RNA提取效果较好,反转录cDNA可以不用试剂盒吗?这笔钱可以省吗?对实验会有影响吗?我主要想做DDRT--PCR.你能和我联系吗?
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问 喵咪 ：提取RNA要注意哪些问题?怎样做可以较好防止降解和污染?听说最好在冬天做,可是我的时间刚好赶到夏天,该怎么办?会有很大影响吗?谢谢回复!
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了组织的RNA提取，过程很顺利，测OD值260nm/280nm=2.4，做RT－PCR，然后跑电泳，结果除了引物二聚体和RT－PCR试剂盒自带的阳性对照以外，没有β－actin出现，也没有目标产物的出现。请问结果怎么解释？
谢谢各位大侠！

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OD值大于2.0，通常是RNA降解了，成为单核苷酸。重提吧。
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,鉴于你做RT很有经验,我想请问一下,如果RNA提取效果较好,反转录cDNA可以不用试剂盒吗?这笔钱可以省吗?对实验会有影响吗?我主要想做DDRT--PCR.你能和我联系吗?谢谢!

================================

可以不用试剂盒，自己摸一下条件即可。

季节没关系的，实在不行，可以开空调嘛  
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你的信任！
不知道你用的是什么方法提取RNA.如果用的是TRizol，和天气是没有关系的。该溶液中含有RNA酶强抑制剂，没有那么容易降解。
一次性耗材如包装完整，是正规厂家生产，没有必有进行灭RNA酶的处理，会适得其反的。
到最后一步溶于DEPC处理的三蒸水后应该尽快进行RT.
RT过程中的RNA的变性比较重要，置于冰水的速度要快。
我昨天的帖子谈到过关于RT-PCR的问题，请查阅。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2011-10-4 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家的关心！
我用的是RNA提取试剂盒。
昨天做了RNA电泳，没有RNA的三条代出现；今天又重新提取RNA（Tip头全重新用DEPC泡了，并高温消毒），并和以前有产物出现的RNA（保存于－70度，1 week）跑RNA电泳，都没有RNA三条代出现。（没有做RT－PCR）
现在考虑RNA试剂盒有问题，打算明天提取正常组织的RNA，看究竟是否有RNA提取出来。
你们觉得呢？
现在真是心力憔悴呀！
谢谢大家！
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