PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 请问：有关RNA提取和RT－PCR

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 23  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:请问：有关RNA提取和RT－PCR

INK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73382
精华 0
积分 348
帖子 375
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
1

发表于 2011-10-4 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：有关RNA提取和RT－PCR

请问：有关RNA提取和RT－PCR [转载]


试剂：RNA提取试剂盒（Promega公司）
RT－PCR试剂盒（大连宝生物公司）
PCR仪
过程：2004年3月12日－2004年3月22日
提取昆明鼠皮肤移植物RNA（组织大小约1cm×1cm）：液氮冻存10min，取出，碾钵碾磨，然后按照试剂盒说明书进行操作，测OD值，做RT－PCR，跑电泳，收集图像。
结果：有RNA提取出来，RT－PCR有结果
2004年4月2日－2004年4月7日
提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后1天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.0），结果查见没有β－actin的条代出现（有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）；将RNA提取物直接跑RNA电泳（电泳槽、电泳液等全部用DEPC处理），没有RNA的三条代出现。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后3天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.4），并与术后1天标本同时做RT－PCR，结果同前，（没有β－actin的条代出现，有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）。跑RNA结果同前（没有RNA的三条代出现）。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后5天）RNA，步骤同前（但是没有测OD值和做RT－PCR），直接跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现。
提取昆明鼠正常新鲜皮肤，步骤同前（没有测OD值），跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现；做RT－PCR，有β－actin的条代出现。

现在考虑实验组没有RNA的缘故是组织细胞量太少，而正常组织的细胞量多故能够提取出来RNA。
请问大家这样分析对不对呢？

谢谢大家！
顶部
8黑眼圈8[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72168
精华 0
积分 227
帖子 193
信誉分 100
可用分 1706
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
2

发表于 2011-10-4 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只能说明你的RNA提的太臭!
连管家基因都没有,那就是RNA没有提到,至于有阳性对照,只能说明你的反转录与PCR过程没有问题!
正常组织提的RNA也不行,有降解,但由于管家基因丰度很高,所以还是有条带!
顶部
冰激凌小姐[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70423
精华 0
积分 216
帖子 212
信誉分 100
可用分 1761
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
3

发表于 2011-10-4 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了你的问题，我考虑没有别的原因，只可能是你提RNA的过程中有RNA酶污染而使RNA降解了，所以你再次提的时候一定要注意污染的问题，所有接触RNA的器具都要用DEPC水处理过高温烤干，超净台要消毒后才用，另外戴口罩和手套也很重要。你如果实在没有把握的话，你可以先跟其它会提的人学一下。
顶部
椰子叶子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70440
精华 0
积分 270
帖子 300
信誉分 100
可用分 2226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
4

发表于 2011-10-4 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主用的是不是Takara的Catrimox-14?
如果是的话，我曾用过这个DD，
感觉得率和Protocol说的有很大的出入，
而且Catrimox-14的获率太低，
与同样1ml的TRIZOL相比，前者获取细胞的量只有后者的1/10
此外，Catrimox-14最好在常温下使用，
不要加Catrimox-14在-80'c超过两个星期－倒不是RNA降解，而是OD260/OD280比值太低,曾经让我郁闷ing半个月．
碾钵碾磨加TRIZOL或Catrimox-14研磨，这很重要

希望对你有用
顶部
+田田+[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71224
精华 0
积分 216
帖子 192
信誉分 100
可用分 1691
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
5

发表于 2011-10-4 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

另外，在碾钵里加trizol碾碎是，要经常加液氮，防止融化，
碾成冰淇淋状后，呵呵，要放至液体变色至澄清后再转移到离心管中
顶部
开心蔬菜帮[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 70426
精华 0
积分 142
帖子 63
信誉分 100
可用分 1001
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
6

发表于 2011-10-4 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
A260/A280都在2.2以上。

=========

降解了
顶部
INK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73382
精华 0
积分 348
帖子 375
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
7

发表于 2011-10-4 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像根据晶美公司的介绍，A260/A280大于2.2是“水解成单核酸”了，我不知道“水解”和“降解”有区别否？
顶部
不懂[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70203
精华 0
积分 208
帖子 195
信誉分 100
可用分 1661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-6
状态 离线
8

发表于 2011-10-4 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

================================================================================================================

你的结果令我很恐怖！！我成功的提取了RNA，但从来没有你的这个比值！如果使用DD水溶解RNA该比值要小一些。但要用BUffer溶，该比值可能在1.8以上，前提是提取的较好。个人见解
顶部
INK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73382
精华 0
积分 348
帖子 375
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
9

发表于 2011-10-4 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先谢谢大家！
不过，唉，我又提了几次RNA，只要一做昆明鼠的就有结果，一做Balb/c→C57的OD比值就偏大，就没有结果。苦恼ing！
顶部
胖小妮子[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 70442
精华 0
积分 149
帖子 77
信誉分 100
可用分 1061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
10

发表于 2011-10-4 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用Invitrogen的TRizol从组织里面提取过100多例的RNA，A260/A280都在1.8左右，最大不超过1.9，最小没有低于1.75，水浴助溶的A260/A280比值稍偏大一些。
顶部
 23  1/3 123››