第一次设计的引物就要订出了,各位高手支招吧! 急啊!!

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标题:第一次设计的引物就要订出了,各位高手支招吧! 急啊!!

脱水萝卜[使用道具]
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发表于 2011-10-4 15:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一次设计的引物就要订出了,各位高手支招吧! 急啊!! [转载]

为克隆EGFP(模板为pEGFP-N2),我设计了一对引物:
P1: 5' AGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTC 3' 有酶切位点EcoR I.(GAATTC)
P2: 5' CTCGGATCCTACAAATGTGGTATGG 3' 有酶切位点BamH I(GGATTC)
用primer5.0 设计,rating 为79分,但两个引物都有Dimer,且P1 中Dimer的自由能高达-11.2,共有四条-10---- -11.2的Dimer.
各位给看看吧,谢谢.这样的引物能扩增出800多的片段吗?能否讲讲,急啊!!
TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG
GATCCACCGG CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA CCGGGGTGGT
GCCCATCCTG GTCGAGCTGG ACGGCGACGT AAACGGCCAC AAGTTCAGCG TGTCCGGCGA
GGGCGAGGGC GATGCCACCT ACGGCAAGCT GACCCTGAAG TTCATCTGCA CCACCGGCAA
GCTGCCCGTG CCCTGGCCCA CCCTCGTGAC CACCCTGACC TACGGCGTGC AGTGCTTCAG
CCGCTACCCC GACCACATGA AGCAGCACGA CTTCTTCAAG TCCGCCATGC CCGAAGGCTA
CGTCCAGGAG CGCACCATCT TCTTCAAGGA CGACGGCAAC TACAAGACCC GCGCCGAGGT
GAAGTTCGAG GGCGACACCC TGGTGAACCG CATCGAGCTG AAGGGCATCG ACTTCAAGGA
GGACGGCAAC ATCCTGGGGC ACAAGCTGGA GTACAACTAC AACAGCCACA ACGTCTATAT
CATGGCCGAC AAGCAGAAGA ACGGCATCAA GGTGAACTTC AAGATCCGCC ACAACATCGA
GGACGGCAGC GTGCAGCTCG CCGACCACTA CCAGCAGAAC ACCCCCATCG GCGACGGCCC
CGTGCTGCTG CCCGACAACC ACTACCTGAG CACCCAGTCC GCCCTGAGCA AAGACCCCAA
CGAGAAGCGC GATCACATGG TCCTGCTGGA GTTCGTGACC GCCGCCGGGA TCACTCTCGG
CATGGACGAG CTGTACAAGT AAAGCGGCCG CGACTCTAGA TCATAATCAG CCATACCACA
TTTGTAGAGG TTTTACTTGC TTTAAAAAAC CTCCCACACC TCCCCCTGAA CCTGAAACAT
AAAATGAATG CAATTGTTGT TGTTAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA
AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT
TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTAAGGC GTAAATTGTA AGCGTTAATA TTTTGTTAAA
ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA
AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA

脱水萝卜[使用道具]
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发表于 2011-10-4 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA
GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG
TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC
GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC
AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA
GGGCGCGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT
CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA
ATATTGAAAA AGGAAGAGTC CTGAGGCGGA AAGAACCAGC TGTGGAATGT GTGTCAGTTA
GGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT GCATCTCAAT
TAGTCAGCAA CCAGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG CAGGCAGAAG TA

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发表于 2011-10-4 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

CGGTCCCAGG GCTGGCACTC TGTCGATACC CCACCGAGAC CCCATTGGGG CCAATACGCC
CGCGTTTCTT CCTTTTCCCC ACCCCACCCC CCAAGTTCGG GTGAAGGCCC AGGGCTCGCA
GCCAACGTCG GGGCGGCAGG CCCTGCCATA GCCTCAGGTT ACTCATATAT ACTTTAGATT
GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC
ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG
ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA
AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG
AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG
TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG
TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA
TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC
TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC
ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA
GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT
CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG
AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC
ATGTTCTTTC CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CATGCAT

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发表于 2011-10-4 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我说了解的EGFP的序列，如下：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
和你的序列中的一样。
我曾经做过EGFP的扩增，我是把它做为融合蛋白连接在我的目的基因的后面，引物设计的时候去掉了ATG，末尾去掉了终止码。
引物如下：
GFP3 (26bp): GCGATATCGTGAGCAAGGGCGAGGAG (EcoR V)
GFP4 (28bp): CGATATCCTTGTACAGCTCGTCCATGC (EcoR V)
条件：94，3‘，94，30“，59，30“，72，1’，30 cycles，72，5‘。扩增的片断经测序及转染证实。
建议你好好查一下你的序列和引物，好像你引物中的序列（除酶切位点外）并不是针对EGFP的。

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发表于 2011-10-4 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[我曾经做过EGFP的扩增，我是把它做为融合蛋白连接在我的目的基因的后面，引物设计的时候去掉了ATG，末尾去掉了终止码。]

.笑佛兄,您好! 您去掉ATG, 那EGFP的转录从哪开始呢,是您的目的基因上有ATG吗? 您末尾去掉了终止码。是否您的载体上有终止密码。如果不这样,EGFP能表达吗?我不懂,能否请您进一步说说?
今天发现一个错误,在引物P1后几十bp还有BamHI位点,故又重新设计了引物,能否请您看看? 多谢了! 还有,我设计引物就是为了在扩增的EGFP两端加酶切位点,以便后续的克隆. [好像你引物中的序列（除酶切位点外）并不是针对EGFP的。]
新引物
P1 5' TTATCAAGCTTCGAATTCTGCAGTC 3' [GAATTC] EcoR I
P2 3' GGTGTAAACATCTCCATCTAGAGGC 5' [AGATCT] Bgl II
rating 76 分 primer 5.0 设计片段844bp包含ATG和终止密码。这对引物怎么样啊?????

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发表于 2011-10-4 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

yes，you are right
。我的EGFP是插入到一个蛋白的中间，因为我需要这个蛋白的c端暴露（其C端有靶向作用）。所以我的EGFP没有atg和终止码。
你的序列和引物，我仔细看了一下才明白，你的扩增片断，除了EGFP本身外，还包括了载体上的一些非编码序列和部分的多克隆位点。里面有HindIII，EcoRI，SalI，KpnI，Xmal，BamHI，NcoI，XbaI和NotI位点。
你在你的EGFP片断里保留了这么多的酶切位点，今后操作会受影响，不方便。
就说这么多吧，还得里自己多考虑考虑。

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发表于 2011-10-4 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这个是用来作对照的, 酶切位点多没关系.而且这样做也是出于得到一个更好引物的考虑. 麻烦您帮我看看新设计的引物吧! 如果行,我就想马上订了,在线等您哦! 谢谢您了,一个热心的高手!谢谢!
你在你的EGFP片断里保留了这么多的酶切位点，今后操作会受影响，不方便 . 会受啥影响啊,酶切位点多不好吗??

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发表于 2011-10-4 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正向引物还可以（Tm 62C），有dimer，但没有什么大问题。但反向引物得互补序列太少了（G＋C 27％），互补序列得Tm只有37C。
另外，提点建议，核酸得序列最好全部由5‘到3’表示。EcoRI和Bgl II得buffer不兼容，今后做双酶切得分两步。

脱水萝卜[使用道具]
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发表于 2011-10-4 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

反向引物5'多加个A怎么样,即P2: 5' ACGGAGATCTACCTCTACAAATGGTGG 3' 或 P2 :5'CCGAGATCTTACAAATGTGGTATGG3' 嘿嘿,,笑佛兄,您是否能帮我设计一下反向引物.提这样的要求是有点过分了,不过是否能请您考虑一下,没办法,谁叫我才疏学浅呢?.

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