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标题:长PCR疑难问题

98776langtao[使用道具]
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发表于 2011-10-4 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

长PCR疑难问题

长PCR疑难问题


我第一次做PCR,欲扩增一条长四千bp片段,模板来自小鼠胚胎干细胞基因组DNA,一对引物分别为:正向5'-CGG AAA TGG ATG GAA GTT TGt gct gca gct-3'
反向5'-cga ata ttg gGA CTG CTC ACG GTA CCA ATA-3'
其中大写的是有效引物,小写部分为酶切位点及保护碱基.
基本的反应条件为:
94度 4分

94度 30秒
55.3度 45秒
72度 10分
30次循环
72度 15分
反应体系为:
10XLA Taq Buf(内含Mg2+,量未知) 5微升
dNTP(10mM) 1微升
一对引物(各0.11微克/微升) 各2微升
模板 3微升(其中DNA含量不详)
LA TAQ酶 0.5微升(含1.25个单位)
重蒸水 36.5微升

总体为50微升

第一次做完电泳结果中有很弱的目的带出现,且杂带很多.但后来再重复时及不稳定,有两次可以看到很弱目的带,有时却看不到任何带,只有一团发亮的荧光.
屡次改变条件,复性温度曾经换成54.2,56,57,模板量曾换成5微升反应体系中也曾加过DMSO,但除54.2度曾经出现过很弱的带外,56,57度下均无任何带出现.

此扩增的产物要用于做连接反应,因此浓度不能过低.

不知道问题在于什么地方,内行的还请指教,多谢,很急!(个人觉得问题可能在于模板)
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发表于 2011-10-4 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想退火温度应该加长一点吧，至少一分钟，试试看
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 小中大
我想退火温度应该加长一点吧，至少一分钟，试试看
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白鸟之翼[使用道具]
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 小中大
我也认为是正向引物的保护性碱基和酶切位点有问题，应该在5'端；另外变性和退火时间不够，请参考。
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98776langtao[使用道具]
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 小中大
正向引物的保护碱基的位置是我打错了,的确是在5'端.还有就是不知道我的预变性时间4分够不够?
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发表于 2011-10-4 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
正向引物的保护碱基的位置是我打错了,的确是在5'端.还有就是不知道我的预变性时间4分够不够?
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-4 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
基因组DNA扩增预变性时间4分钟应该够了,我觉得你的模板纯吗?
而且LA TAQ酶的dNTP是自带的,我做过按要求加了8ul(100mm的),你用的不是原配的吗?怎么才加了1ul
另外可以试试用touch-down PCR(降温PCR),如果你的引物没有问题的话,应该可以扩增出东西来啊.
仅供参考!!!
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 小中大
我现在用的LA Taq酶有附带的dNTP,但我没有要,而且我用自己已经有的dNTP(浓度为各10mM)也得到过两三次目的带,只是很淡,大部分时候没有任何带.模板基因组DNA是别的单位提取的,不是我自己提取的,所以含量和纯度不清楚(由于模板量很少,所以没有作DNA含量的分析).
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 小中大
我现在用的LA Taq酶有附带的dNTP,但我没有要,而且我用自己已经有的dNTP(浓度为各10mM)也得到过两三次目的带,只是很淡,大部分时候没有任何带.模板基因组DNA是别的单位提取的,不是我自己提取的,所以含量和纯度不清楚(由于模板量很少,所以没有作DNA含量的分析).
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发表于 2011-10-4 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议引物重新设计，增加退火温度
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