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标题:[求助]如何才能提高PCR的产量

koook5695[使用道具]
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[求助]如何才能提高PCR的产量

[求助]如何才能提高PCR的产量


各位朋友,我现在是非常迷惑,由于以前我的PCR条带较弱,昨天我将DNTP的量稍微加大了一点,只是1UL而已 其它的条件,每变,你猜结果怎样?没有条带!各位高手我现在该怎么办,怎样才能提高PCR的产量呢?恳请回复!
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阿拉蕾[使用道具]
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影响PCR产物的量的因素有很多:
1)PCR的体系组成的合理,尤其是适宜的引物和模板的浓度,如果某种成分的量加大或减少都会显著的影响PCR的产量和特异性;
2)合适的模板浓度:起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意,104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到,所需的最佳模板量取决于基因组的大小;
3)酶的选择:除了使用高质量模板DNA,聚合酶的选择也会影响产量;
4)PCR反应体系的组成,如酶离子的浓度等也会显著影响 ;
5)PCR条件,如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键;
6)如果PCR产量较低的话,你也可以通过二次PCR来提高产量,即把第一次的PCR产物适当稀释,再以它作为模班进行PCR,同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。
同时推荐你一个比较好的网叶,也许能帮助你!
cuturl('http://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/content/Frameset1.htm')
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#甜#[使用道具]
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看来pcr还有些娇贵偶.加样时混匀是非常重要的我感觉,注意偶
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天蓝蓝[使用道具]
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DNTP可以和Mg离子结合,从而改变反应体系中镁浓度,影响taq酶的活性。条带弱加大DNTP是没用的,你可以增加一下循环次数,降低退火温度,略增加引物量试一试。有时候换换酶也是可以的
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koook5695[使用道具]
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5
 
谢谢各位的帮助,我的模板的浓度就是很底的。我也曾尝试着用PCR产物再扩增,可是我没有结果,我不知道该怎么解决,能帮我吗 ?
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koook5695[使用道具]
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我现在该怎样提高PCR的产物呢?
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试试增加Mg++浓度,降低退火温度,增加循环数!可能会有所改善  
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koook5695[使用道具]
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8
 
我的退火温度是55度,循环次数是35次,Mg++的浓度是1。5mmol/l,这些都是参照有关文献报道的,
在这我再问一个弱智的问题:提取的DNA跑电泳,如果没有条带,或条带很弱,是不是就不能扩增出产物呢?
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阿福[使用道具]
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DNA跑电泳,没有条带与条带很弱是有差别的,你要优化PCR反应条件,如做温度梯度试验,提高Mg++的浓度到2mM,dNTP到400uM只是增加了非特异性,P出来没有问题!
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koook5695[使用道具]
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10
 
外周血DNA可以扩增出产物,条带也不是很弱,只是石蜡组织DNA却扩增不出来,请问我现在需要改变反应条件吗?
其实石蜡组织DNA 跑电泳没有发现有条带,是不是DNA提取有问题,但是OD值是有的,请问原因?
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