PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下

purrr[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
1

发表于 2011-10-5 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下

PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下 [转载]


本人摸索PCR近半月苦于没有结果或特异性条带瞪大眼才偶见，再改变了循环方式后轻松扩得特异性清晰条带，怪！可能是先加酶者酶衰减了。
95度 10min
94度 1min
56.5度 1min
72度 1min 30个循环
72度 10min
顶部
不懂[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70203
精华 0
积分 208
帖子 195
信誉分 100
可用分 1661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-6
状态 离线
2

发表于 2011-10-5 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不清楚楼主为什么要95度10min，你的模板有特别的地方吗，一般有3分钟就可以了，TAQ酶可以直接加进去，95度几分钟并不至于会出现实验出不来的情况，除非你的酶本身有问题。
顶部
胖小妮子[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 70442
精华 0
积分 149
帖子 77
信誉分 100
可用分 1061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
3

发表于 2011-10-5 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
95C，10分钟一般是用在TaqGold酶的，Gold的酶需要加热10-12分钟来激活。如果你是用一般的Taq酶是不需要这一步这么长的，否则Taq的活性反而会受损。而且，大家一般是在95C以后再加酶进行循环。不过我们用Gold类型的酶都是要加热激活，所以一开始就加进去一起反应。
顶部
椰子叶子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70440
精华 0
积分 270
帖子 300
信誉分 100
可用分 2226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
4

发表于 2011-10-5 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
95C 10min，是为了将基因组中的DNA尽量的完全变性，以使为数不多的目的序列得到扩增呀，这样做有没有用呀？
TaqGold酶是啥酶呀？俺没听说过呀
顶部
coolcool[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72942
精华 0
积分 264
帖子 227
信誉分 100
可用分 1941
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
5

发表于 2011-10-5 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TaqGold是经过化学修饰过的Taq酶，就比一般的Taq好，只有加热后才有活性，防止非特意扩增。
顶部
ha111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72969
精华 0
积分 821
帖子 1239
信誉分 101
可用分 7048
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
6

发表于 2011-10-5 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我见过一篇文章：95度15分钟进行预变性（Molecular Psychiatry （2000）5，531~536）。有些目的片段的GC含量很丰富，为了充分的变性，常有这种操作方法。但一般的Taq酶95度半衰期只有40分钟，所以常常采用预变性后再加酶。
顶部
假小子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70089
精华 0
积分 159
帖子 97
信誉分 100
可用分 1206
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-4
状态 离线
7

发表于 2011-10-5 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼主的观点！偶用一般的PCR出不来
改做96度预变性10min后，加一般的taq酶进行循环，结果就出来了
目的片段1kb，偶也觉得这样做是为了更好的使模板变性！
顶部
芙蓉宫主[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74047
精华 0
积分 155
帖子 69
信誉分 100
可用分 1071
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
8

发表于 2011-10-5 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你10分钟变性是可以，但Taq酶最好要在这一步之后加进去。
顶部
芙蓉宫主[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74047
精华 0
积分 155
帖子 69
信誉分 100
可用分 1071
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
9

发表于 2011-10-5 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你10分钟变性是可以，但Taq酶最好要在这一步之后加进去。
顶部
pou[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72980
精华 0
积分 408
帖子 496
信誉分 100
可用分 3311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
10

发表于 2011-10-5 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在做的PCR扩增程序跟楼主差不多，先94度预变性10分钟，然后加入酶进入扩增循环。我查资料发现，用这个步骤的作用在于可以消除反应系统中可能污染的核酸酶以及蛋白酶，并且可以提高器始模板的变性效果，保存酶的活性。我用的也就是普通的酶。  
顶部
 18  1/2 12››