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标题:[请教]有关测序的一个问题

爬呀爬[使用道具]
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发表于 2011-10-6 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[请教]有关测序的一个问题

[请教]有关测序的一个问题


我正在做一个先天性疾病的基因测序，假如这个基因是杂合的，一个染色体上的基因是发生突变的，其等位基因是正常的，我把其PCR出来，那么这个PCR产物应该是两种序列的混合物，一种是突变的，一种是正常的，如果这样送去测序的话，会有什么结果呢？
还有如果我不知道这个基因是杂合还是纯合，我怎么去断定是杂合还是纯合呢？
还有啊，出了简单的PCR后，直接测序外，还有什么其他好办法，我对这些很不懂，希望得到大家指点。  
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发表于 2011-10-6 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR产物最好是连到T-A载体中再测序，测序结果用BLAST比对，判断是突变的还是正常的。
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发表于 2011-10-6 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR产物直接测序，如果是两种序列的混合物，那么在杂合的测序原始峰图应该是双峰!纯合的就是单峰(测序精度高且重复测序的结果一致)。我现在没有原始峰图，不然就给你一个例子。

其实知不知你的PCR产物是杂合还是纯合，并没关系。PCR产物测序直接看测序看结果!
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发表于 2011-10-6 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那如果PCR扩增出来两个片段，这两个片段具有高度的同源性，长度一样（200bp左右），可能只存在一个碱基的差别，测序的结果是什么样子呢？有什么办法能把这两个片段分开测序吗？
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发表于 2011-10-6 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
连接在测序载体上，多测几个克隆，运气好的话有可能测到两个片段
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发表于 2011-10-6 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正在做一个先天性疾病的基因测序，假如这个基因是杂合的，一个染色体上的基因是发生突变的，其等位基因是正常的，我把其PCR出来，那么这个PCR产物应该是两种序列的混合物，一种是突变的，一种是正常的，如果这样送去测序的话，会有什么结果呢？
还有如果我不知道这个基因是杂合还是纯合，我怎么去断定是杂合还是纯合呢？
还有啊，出了简单的PCR后，直接测序外，还有什么其他好办法，我对这些很不懂，希望得到大家指点。

================================================================================================================

可以用dHPLC（denatured high pressure liquid chromatography technique）的技术尝试一下，这是一种比直接测序便宜并且比较适合大样本筛查的检测多态性的方法。通过不同melting temperature下出双峰还是四峰来判断某一段序列中是否存在SNP，是杂合还是纯合。这种方法非常适用于“具有高度的同源性，长度一样（200bp左右），可能只存在一个碱基的差别”的情况。
下图是个示例图：The dHPLC Polymorphism Discovery


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发表于 2011-10-6 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
测序基本可以解决你的问题：
如是杂合子变异，会出现双峰；
如是纯合子，就是单峰；
想分开这个双峰，用Mutation Surveyor 软件。
软件简介：cuturl('http://www.todaysoft.com.cn/surveyor.htm')
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-10-6 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
杂合子测序的结果就是在突变位点出现两个峰，而纯合自只有一个峰。见下图：
我这个图比较特殊一些，杂合子的两个曲线基本一样高，通常情况是高低不一的，因为一时找不好图就讲究吧。
还有分别一个基因的突变200bp片断可以用SSCP方法试试，只需要一台垂直电泳仪就可以了，成本很低，但是可能需要摸条件，看你运气了。当然有些突变用SSCP也不一定能检出。其实我觉得如果有资金的化最好的最直接的方法还是测序。


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98776langtao[使用道具]
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发表于 2011-10-6 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手. 请问: 如果是杂合子, 正向测序是双峰, 那么反向测序是否一定为互补碱基的双峰啊? 请您及时回复, 谢谢!!!
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2011-10-6 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好!!
我是新手. 请问:
1. 如果是杂合子, 正向测序是双峰, 那么反向测序是否一定为互补碱基的双峰啊?
2. 如果基因测序图谱中噪音比较大, 出现双峰, 要明确是否是杂合子, 那么
低峰达到高峰的多少(百分比)可以判断为杂合子突变??

请您及时回复, 谢谢!!!
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