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标题:[急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？

阿敏[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？

[急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？


小妹刚开始设计试验，很菜鸟，想请问各位大侠：我做子宫内膜癌的两个基因的rtpcr，石蜡标本可以做rtpcr吗，有什么特殊要求？如果要用冰冻的收集时该注意那些问题呢？
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当然可以，查询：石蜡包埋组织的DNA提取及其应用
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阿敏[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢主任，不过大概是我没有讲清楚，我要做的是提取mRNA,逆转录cDNA.听说用石蜡切片很难出结果。
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阿敏[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢主任，不过大概是我没有讲清楚，我要做的是提取mRNA,逆转录cDNA.听说用石蜡切片很难出结果。
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RNA早降解了，还怎么作RT-PCR！即使是新鲜的标本如果没有及时放入液氮冻存都作不出来。
别在这上面浪费时间了。
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发表于 2011-10-7 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
理论上是可以的，也有报道作出来的，但我周围没有，如果有时间和钱，可以一试，否则，就别浪费了
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关键是从石蜡组织中提取RNA，我用如下方法：
1.  切片8μm×10张，置1.5ml EP管
2.  脱蜡：加二甲苯1200μl, 震荡混匀，8600rpm, 10 min ×3
3.  无水乙醇1200μl, 震荡混匀，8600rpm, 5min ×2
4.  吸弃乙醇，37℃ 烤箱干燥30min
5.  加裂解液 200μl，酶K（20mg/ml）5μl
6.  组织溶解后，95℃水浴10min,
7.  4℃冰箱冷却
8.  加1mlTrozol混匀，
9.  加氯仿200μl，充分混匀，置3min
10.  4℃, 13000rpm 15min.
11.  吸取水相，加入等体积的异丙醇，-20℃ 2h
12.  4℃, 13000rpm 15min.
13.  弃上清，加75%乙醇1200μl清洗，
14.  4℃, 11000rpm 10min.
15.  弃上清，室温干燥8min，加20μl DEPC水溶解RNA，55℃ 10min
16.  -70℃保存
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按上面的方法提取的石蜡组织里的mRNA ,效果不错.
操作要注意:
1.注意DEPC消毒
2.活检组织及早固定\包埋
3.注意实验的第一步里,切片了马上开始提取
4.提取MRNA时,最好有人在一旁指导.
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发表于 2011-10-7 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于韩梅梅网友“石蜡组织中提取RNA”的几点商榷：
1、石蜡包埋组织大多来自病理科，这种组织一般是从手术室几经周折到达病理科，其中间环节较多，很少有人会注意避免RNA的降解，因此这些组织中的RNA是很难逃脱降解的命运；
2、即使有RNA保留也很难逃过上述脱蜡、烘烤等处理过程；
3、“DEPC消毒”表达不妥，其作用是灭活RNA酶；
4、石蜡包埋组织中DNA提取绝对没问题，提取RNA恐怕...............？
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冰激凌小姐[使用道具]
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 小中大
我有个师姐曾经用石蜡切片做过原位杂交，可以得到阳性结果，但用的是新鲜制备的蜡块，作RT也应该没问题吧
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