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标题:[求助]HindⅢ和BamHⅠ在一起怎么切？

mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-10-7 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]HindⅢ和BamHⅠ在一起怎么切？

[求助]HindⅢ和BamHⅠ在一起怎么切？


本人设计引物时不小心加了这两个酶切点。现在发现New England(neb)的书（该书有一个双酶切体系表）上说这两个酶不能同时切（BamHⅠ有专门的buffer)。于是我做了两步切，每步胶回收，但DNA损失殆尽，连接时没接上。

我很是头疼，该怎么办？
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-7 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
何必两步回收呢
切了一个灭活十分钟 继续切
或者换MBI的酶
它有通用的buffer 用2X的
不过NEB的酶是最好的了 没有必要换了
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=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-10-7 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该有通用的Buffer.  
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-10-7 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以用NEB的buffer 2 啊
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发表于 2011-10-7 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人设计引物时不小心加了这两个酶切点。现在发现New England的书上说这两个酶不能同时切（BamHⅠ有专门的buffer)。于是我做了两步切，每步胶回收，但DNA损失殆尽，连接时没接上。

我很是头疼，该怎么办？

==========================================

只需要做一步双酶切，可以用TaKaRa推荐的1xK buffer.
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2011-10-7 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
何必两步回收呢
切了一个灭活十分钟 继续切
或者换MBI的酶
它有通用的buffer 用2X的
不过NEB的酶是最好的了 没有必要换了

=======================================

灭活酶有什么用啊，主要是buffer中的盐得改换。

另外：本实验室都用neb的酶，takara的也有(不过好像是两年前的），但takara的BamHⅠ也是有专门的buffer的啊。
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发表于 2011-10-7 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 先切一个,后在体系内加等体积 氯仿:异戊醇 (24:1), 混匀,13000rpm 5min
2. 取上清,加1/10 3M 乙酸钠和双倍体积的无水乙醇,沉淀3小时以上(最好过夜),
3. 13000rpm 5min 弃上清
4. 加体系,进行第二个酶切
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2011-10-7 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用BamHⅠ的buffer切!不行再用NEB的buffer 2试一试.详见:cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=940309&sty=1&tpg=1&age=0')
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发表于 2011-10-7 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老板要我就用neb的buffer2一步来切，虽然我很是怀疑，但今天的结果却是出奇得好。8个菌落酶切中有2个是阳性克隆，自身环化对照没有长（自身环化的既然没长，那6个阴性的细菌是什么呢？）。（pcr我也做了，结果也是一样）

好奇怪啊！neb这么大的公司也说胡话：）！怪！
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131415[使用道具]
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发表于 2011-10-7 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我常用takara 的HindⅢ和BamHⅠ用1xK buffer一步ok了.  
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