[精华]酶切问题讨论专栏

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标题:[精华]酶切问题讨论专栏

3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[精华]酶切问题讨论专栏 [转载]

如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！

1.PCR产物的酶切。
PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:

PCR产物的酶切相关的帖子：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/242899_1.html')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/818980')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/620693')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/720799')

2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：
（1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：
（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:
cuturl('http://circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html')。
（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大；
（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

（2）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

（3）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

（4）酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！

(5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

相关帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/886961')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/458396')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/893847')

关于保护碱基的资料:

Cleavage Close to the End of DNA Fragment1.doc (104.5k)

+田田+[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问前辈：为什么双酶切时要先切低温再切高温？
如果酶切过夜会影响酶切效果吗？

coolcool[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

主要是考虑到酶活性的维持。
温度对酶的活性影响很大，温度高，容易造成某些酶的失活；双酶切时，由于有2种的限制酶存在，2种酶可能有不同的最适反应温点，当1种酶在其最适温点反应时，为了不使另1 种酶降解或失活，所以双酶切时要先切低温再切高温。

seven7[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问PCR产物酶切过夜，对连接没影响吗？

邀月[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

紧急求助！万分感谢！！！构建vector 3个月没结果！
我的载体是PstI单酶切，脱磷。目的片段是PCR产物切胶回收PstI单酶切（切2.5h,引物设计加6个保护碱基),，然后又切胶回收，再连接，阴性对照长一些兰斑（可能脱磷不彻底），但样品只长几个白斑，鉴定全是假的。请问高手问题出在哪？是不是目的片段没切动导致没连上？载体是pCAMBIA1300, 目的片段9.7kb。

koook5695[使用道具]
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发表于 2011-10-7 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的目的片段9.7kb,有点大, 胶连有点困难了.可以考虑液连.用Agrose酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.

还有就是你的PCR产物PstI单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果.可用一有PstI酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.

你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP一定要保证活性.最好用

新的.

applebook=213[使用道具]
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