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标题:[求助]全血中DNA的快速提取方法

荒漠孤驴[使用道具]
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[求助]全血中DNA的快速提取方法

[求助]全血中DNA的快速提取方法


我想从全血中提取DNA的简便快速的方法,用于PCR?请教各位老师有什么有效的方法?谢谢!  
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章鱼小丸子[使用道具]
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我自己用的是盐析法,但有一步蛋白酶K消化过夜的过程,所以并不快,下面的方法是转贴的,我自己没有用,可是确实是。。。快

外周血DNA提取方法(protocol)
从300μl全血中分离DNA
时间:45分钟
预期产量:5-15μg DNA

细胞裂解
1. 将300μl全血(或骨髓)加入盛有900μl红细胞裂解液的1.5ml的微型离心管中。翻转使其充分混合,在室温下孵育10分钟。在孵育期间至少翻转离心管一次。
2. 在13,000-16,000g下离心20秒钟,用一支移液管移走悬浮液,留下可见的白细胞层和10-20μl的残液。
3. 猛烈震荡试管,使残液中的细胞悬浮。
4. 将300μl细胞裂解液加入悬浮的细胞中,用移液管混合,通常不需要孵育。若混合后细胞环可见,在37℃或室温下孵育直至完全裂解。室温下,样本可在细胞裂解液中稳定保存至少18个月。

溶解DNA
1. 将100μlDNA溶解液加入离心管中(若总产量为10μg/DNA,浓度可为100μg /ml)
2. 将样本于65℃孵育1小时或/和室温下过夜,以使DNA溶解,有规律地轻拍离心管以帮助DNA的分散。
3. 于4℃下储藏DNA,若欲长时间存放,置于-20℃或-80℃储存。

蛋白质沉淀
1. 使样本降至室温
2. 将100μl蛋白沉淀液加入到细胞裂解液中。
3. 快速震荡试管20秒钟,使二者充分混合。
4. 于13,000-16,000g离心3分钟。沉淀的蛋白质应该形成一个紧密的,暗棕色的片层。若其不够致密,重复步骤3,在冰块中孵育5分钟,然后再重复步骤4。

DNA沉淀
1. 将含有DNA的上悬液倒入一个干净的含300μl 100%异丙醇的1.5ml微型离心管中。
2. 轻轻翻转试管50次以混合样本。
3. 于13,000-16,000g离心1分钟,DNA呈现为一白色片层。
4. 将上悬液弃置,将试管倒扣在一张干净的滤纸上,使液体自然流干。加入70%乙醇,翻转试管数次,以充分洗净DNA层。
5. 于13,000-16,000g离心1分钟,仔细弃置乙醇。DNA环可能松散,因此请务必小心仔细。
6. 使试管倒扣在一张干净的滤纸上,使乙醇自然流干。也可于空气中放置10-15分钟使其晾干。
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DDD[使用道具]
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一滴血直接用于PCR,不知道你听说过吗?速度更快!!
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海鸥crazy[使用道具]
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很多方法,用试挤盒提取,好多公司都有卖的。有好多种,你可以看看他们的网站。告诉你一个cuturl('www.takara.com.cn')
就象chengtc所说,一滴血就可以测,不过贵一点!
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冷眼相对[使用道具]
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我做的是这个方面
我购买了TAKARA试剂盒,590元,50次的,效果还可以。但提取过程得摸索几次才行,特别是步骤中有一步有机相和无机相的分离,我可使搞了几次才成功,现在提取的DNA不用测吸光度我也相信一定适合PCR了。我做的PCR结果到目前为止已经出来了清晰的阳性条带,只是还有几条杂带待消。
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冷眼相对[使用道具]
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我做的是这个方面
我购买了TAKARA试剂盒,590元,50次的,效果还可以。但提取过程得摸索几次才行,特别是步骤中有一步有机相和无机相的分离,我可使搞了几次才成功,现在提取的DNA不用测吸光度我也相信一定适合PCR了。我做的PCR结果到目前为止已经出来了清晰的阳性条带,只是还有几条杂带待消。
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荒漠孤驴[使用道具]
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谢谢大家了,请教高手,你提供的方法中红细胞裂解液、DNA溶解液、蛋白沉淀液的详细成分是什么呀?
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天蓝蓝[使用道具]
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我现在想从牛血中提取DNA用于PCR,不知用什么血液抗凝剂较好、对PCR影响最小?抗凝剂具体是什么组成?
谢谢!
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wu11998866[使用道具]
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这个方法是我转来的,自己没有用过。我用的方法中的红细胞裂解液是TNE。DNA溶解液是TE。但我的方法需要用蛋白酶K消化过夜,所以速度较慢。至于抗凝剂,我用的是柠檬酸0.48g+柠檬酸三钠1.52g+葡萄糖1.47g,再加三蒸水至100ml配成的。
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鸽子不哭[使用道具]
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对呀,现在就是Protease K处理时间太长了,但为何Qiagen等血提取试剂盒中处理时间却很短而且效果不错呢?
至于抗凝剂,这是分子克隆手册上推荐的,想必也适用于牛血吧?
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