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标题:【求助】PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮...

蒲公英[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮...


各位，我两次PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮是怎么回事。模板是1ul，体系25ul。电泳上样量是PCR产物6.5ul，6×buffer1.5ul，制胶时用的是八孔的梳子（北京六一的第二小的梳子，还有11孔的）！
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蒲公英[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
晕了，不会把，我以前也是用同样的方法，同样的体系，作出来效果不错阿，现在不只怎么回事，帮帮忙啊！！！
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4楼
胶是不是旧了?
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发表于 2015-12-30 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的模板为2ul, 体系20ul都还暗呢, 建议你
1、增加模板量
2、检查引物是否有问题
3、使用合适的buffer
4、体系各组分含量做一个梯度对比一下
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 小中大
胶是不是旧了?
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发表于 2015-12-30 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是你的模板降解了，建议加大模板量试试。如果条带比较干净，没有非特异的扩增，可以试着增加cycles。不知道你的PCR程序是什么，可以试着调整延伸时间，都可以增加产量。
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发表于 2015-12-30 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的PCR体系是：
10×PCR Buffer 2.5μl
DNTP 2ul
上流引物 (10 pmol/μl) 1μl
下流引物(10 pmol/μl) 1μl
taq酶 0.125ul
cDNA 1ul
灭菌蒸馏水to 25ul
94℃ 3min
94℃ 30s
55℃ 40s
72℃ 40s
72℃ 10min
4℃ for ever
35个循环
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pore[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、确定模板没有问题，可以单独对模板进行电泳。
2、引物是否合成时间太久，怎么贮存的，如果不是新合成的，或者不是新鲜稀释的也会出现这种情况。
3、扩增片段有多长，可以适当增加延伸时间。
4、循环次数应该足够了。
5、Taq是国产的还是进口的，最好用进口的，或者可以换用PFU试试。
6、不要泄气，不断改变条件，也可以再讨论。我当时摸索着做了半年的PCR呢呵呵，望对你有所帮助。
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蒲公英[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！现就你所提的问题做以下解释：
1. 模板我没用跑电泳，不知道有没有问题。我用同样的条件曾经跑出来的电泳很亮，但是后来有重新反转录的，有一次的也挺好。
2.引物是刚合成的有一个月吧，-20℃储存。
3.目的片断550bp，延伸时间应该够了吧。
4.Taq是TAKARA的应该也没有问题吧。
如果要优化PCR条件，具体优化那些，怎样优化？
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koook5695[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TAKARA的酶是新的吗？有段时间我们买的TAKARA的酶用过几次后，扩增效率就特别低，目的条带特别淡。换了个酶就很好了。
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