PCR仪

我正在做一个大约7KB的3‘RACE。目前结果很不理想，电泳跑出来的一个非特异性条带，以及一大片的smear
请问这里又没有做过这种长片段RACE的同志，能否指教一下。
谢谢！

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本人曾经做过RACE，不过扩增的片段没你的那么长，也没有使用试剂盒，虽然在做3‘RACE时不是很顺，可还是做出来了。由于不知你的具体情况，不能妄加分析，如有兴趣可以就此探讨一下！

我用的是Ambition的kit.
RNA是原来抽提冻存的，用的酶是 MMLV。
PCR做了两轮，第一轮是我的GSP和KIT里的OUTER PRIMER做的，
94 4min
94 30sec 52 30sec 72 5min 35cycles.
72 10min
SMEAR很厉害，在1000BP出现非特异性条带。
第二轮是GSP和INNER PRIMER做的，条件和第一轮差不多，就是退火温度改为56度。
出来也是SMEAR很多，在700BP出现非特异带。

请大家指教一下问题所在。

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针对楼主情况，有建议如下：
1、检测RNA是否降解，只有确认没有或只有轻微降解后面的实验才有意义；
2、每一轮PCR都需要做个梯度找出最佳退火温度；
3、用于第二轮巢式或半巢式PCR模板的第一轮产物应该以不同倍数稀释；
4、对于扩增较长片段应该适当延长变性时间；
5、GSP引物设计也不容忽视，需要保证较好的特异性；
6、使用LA Taq酶，并配以热启动；

佩服楼主的设计
偶做个2。5k的race就费了九牛二虎之力
建议你还是分段扩吧
不然对RNA的质量要求太高了
而且RT反应也走不了那么长

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分段扩需要知道一些中间片段，困难很大。
RT的话，如果选择比较好的酶，我感觉做这么长问题应该不大的吧。