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酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素（一）

关键词：国家一级标准物质  生物成分分析标准物质  食品添加剂检测  食品农药残留检测
    【实验原理】
    酶联免疫吸附试验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除将标准品、待测样本加入到预先包被hCG单克隆抗体(McAb)透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。加入底物四甲基联苯胺(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人hCG浓度呈正相关，450nm波长下测定A值，根据标准品的浓度及对应的A值，可计算出样品浓度。
  【试剂与仪器】
  酶联免疫试剂盒测定hCG的主要试剂与仪器：
  1．包被固相载体用的β-hCG亚基McAb
  2．辣根过氧化物酶(HRP)标记的β-hCG亚基McAb
  3．在HRP反应中作底物的TMB
  4．H2SO4终止液
  5．37℃恒温箱
  6．标准规格酶标仪
  【操作步骤】
  1．样本
  (1)收集晨尿，1500～2000r／min离心10分钟，取上清液待测。
  (2)采血不加抗凝剂，尽快分离血清待测。
  2．准备  从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
  3．配液  用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
  4．加标准品和待测样本  取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50µl；待测样本孔中先加入待测样本10µl，再加样本稀释液40gl(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。
  5．温育  37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟。
  6．洗板  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
  7．加酶标工作液  每孔加入酶标工作液50µl，空白对照孔不加。
  8．温育  37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟。
  9．洗板  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
  1 0．显色  每孔先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，平板混匀器混匀30秒(或用手轻轻振荡混匀30秒)，37℃避光显色15分钟。
  11．终止  取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应(颜色由蓝色立转为黄色)。
  12．测定  以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(A值)。
  13．计算根据标准品的浓度及对应的A值，可计算出样品浓度。