小中大我做的是已知一段EST序列，要扩出全长。用的是clonthch公司的试剂盒。试剂盒所提供的阳性对照（运铁蛋白受体，3‘端大约长2.3kb,5' 端大约长2.9BP）都可扩出来，但实验标本都扩不出来。现用takara LATaq ,不知是片段太长还是GC含量太高。反应条件：94度5秒，72度2分，5个循环；94度5秒，70度10秒，72度2分；5个循环；94度5秒，68度10秒，72度2分；27个循环。总是没有条带出现。马上就要开题了可什么都没做出来。各位有什么好的建议、想法请告知。不胜感激！！！
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粗略看过你的反应条件，总感觉不够合理：首先没有预变性阶段，94度5秒似乎短了些，模板不能充分变性，72度2分也短了，其余的时间也都相对不够。此外，好象clonthch公司的试剂盒也未曾提供类似的参数。
