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标题:[求助]如何鉴定引物质量？

Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何鉴定引物质量？

[求助]如何鉴定引物质量？    [转载]


是否可以通过1.5%胶直接上样电泳，跑5-10分钟看有没有条带出现？  
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我扩增PCR总是没有结果，只在前面看见亮亮的引物二聚体。郁闷的很，我用的25ul体系，而且是剃度PCR，体系是25ul体系，其中镁浓度是1.5mmol/l，taq酶2.5个单位，引物分别为25pg，哪位高手给点建议！
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wawa[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你可以看看引物和承德是否正确，如果确定自己的pcr 反映体系和条件没问题的话，有可能是引物合成有问题，我们这就有人碰到过，虽然纪律很低
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sunshine039[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先:先核查一下你的引物序列,看有无问题,一般出现错误的机率很小.
其次:你的反应体系没有问题,但是DNA模板有没有问题,建议用紫外分光光度计测定模板DNA吸光度,也可直接用5ul模板跑电泳看看.
还有就是你的循环设置也需要在摸一下.
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢上面各位兄弟的回答，今天下午我又跑了次，DNA模板没有问题，而且是我刚提取的DNA，我又看到前面有非常明亮的引物二聚体，后面什么也没有！！！！！是否可能引物浓度太大，导致模板反倒合成不了，或者引物有问题，容易形成二聚体？可是有一次我用一个剃度50-60度每管都合成了我的目的基因，那次后我再用同样的条件又出不来了（当然前面还是有比较多的引物二聚体！），着急死了，不知道怎么回事，各位兄弟再帮小弟诊断诊断！！非常感谢！
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起，楼主，您提供的信息少了一点，楼上几位的意见您给反馈一下就好了。
至于引物，想用琼脂糖电泳分析是不可能的，你可参照引物合成单背面的指导，用PAGE胶跑一下看看；或者也可以找个灵敏度高点的紫外测以下（岛津新出的一款BioSpec-mini 核酸/蛋白质分析仪就可以，输入序列后还可以直接得出浓度）。
另外，我听说的引物浓度都以mol数来计（这样才能保证两条引物浓度匹配！！！），一般上下游引物的终浓度各为0.1~0.4 uM，引物太多、而模板又太少时，就只会出二聚体了。
供参考。
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起，楼主，您提供的信息少了一点，楼上几位的意见您给反馈一下就好了。
至于引物，想用琼脂糖电泳分析是不可能的，你可参照引物合成单背面的指导，用PAGE胶跑一下看看；或者也可以找个灵敏度高点的紫外测以下（岛津新出的一款BioSpec-mini 核酸/蛋白质分析仪就可以，输入序列后还可以直接得出浓度）。
另外，我听说的引物浓度都以mol数来计（这样才能保证两条引物浓度匹配！！！），一般总浓度各为0.1~0.4 uM，引物太多、而模板又太少时，就只会出二聚体了。
供参考。

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呵呵，谢谢了，我今天晚上就把引物浓度换小一点，至于引物浓度是pmol，见晾！希望明天出来结果！
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泉水叮咚[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起，楼主，您提供的信息少了一点，楼上几位的意见您给反馈一下就好了。
至于引物，想用琼脂糖电泳分析是不可能的，你可参照引物合成单背面的指导，用PAGE胶跑一下看看；或者也可以找个灵敏度高点的紫外测以下（岛津新出的一款BioSpec-mini 核酸/蛋白质分析仪就可以，输入序列后还可以直接得出浓度）。
另外，我听说的引物浓度都以mol数来计（这样才能保证两条引物浓度匹配！！！），一般上下游引物的终浓度各为0.1~0.4 uM，引物太多、而模板又太少时，就只会出二聚体了。
供参考。

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引物太多、而模板又太少时，就只会出二聚体了。
这是真的吗？那是不是有假阴性结果，我的模板量恰恰很少，是未经过培养的直接从临床采集的细菌悬浮标本。

那是不是会有很多假阴性结果？
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爆炸头[使用道具]
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发表于 2011-10-8 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要的3个基因全部扩出来了，就换了一种TAQ酶，其它 的条件没有变什么，哎，整整摸了10天的条件，什么都没有，把人都快逼疯了，现在不管怎么改体系，瞎做都能得出我要的结果，靠！给大家推荐一种非常好的酶，中科开瑞公司的酶，很不错，上海产的，22分一个单位
虽然失败这么久，可是真正感觉到失败是成功他妈！只要不懈的努力总会成功的，欢迎大家和我讨论关于PCR方面的问题！  
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