小中大我也正在做RACE，有一些经验分享：
1、我用的是BD clontech Co的SMART RACE kit，我要扩的目的基因丰度比较低，所以扩中间片段就花了很长时间，我的意思是说，中间片段首先必须确证，我作了3次，测了3次，换了两次引物，确定无误，开始作RACE引物；
2、引物我使用了巢氏扩出来的，不用巢氏的没有结果，另外，最好做二次，而且目的片段并不是非常单一，最终选择不同条带做克隆，确定了5‘端，但3’端还是不正确，我还在做3’端；
3、正如楼上所说的，RNA要及时提，且一般都要用甲醛变性电泳验证。
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谢谢你的经验分享，我的也用巢式PCR（基因特异引物）扩增过啦，但是出来的条带主要是单引物扩增的结果（和只加RACE公共引物的结果带形一样），为了便于大家分析，我将我的RACE过程简述如下：
首先我用兼并引物扩增中间片断，经过测序验证是我要的基因，然后根据这个片段，我设计啦两对引物，再从模板中做巢式3‘和5’RACE,结果是第一论有些条带，但是大小和我的预期不相符，为了保险起见，我将其中的和我的目的片段大小较接近的片段和一些大片断科隆测序，结果都没有拿到我要的基因，于是接着做第二论pcr，结果就是单引物扩增，烦啦，我就重新合成模板（做过两次，用的trizol试剂一步提取的RNA，然后用总RNA直接逆转录而成第一链作为RACE的模板，中间我没有对总RNA进行定量和质量分析，不过最近的一次总RNA我直接在普通的琼脂糖电泳设备中进行过电泳分析，结果是很漂亮的两条带，28s和18s明显，上面的条带明显亮，但是令人气氛的是，就是这次检测过的模板做race竟然第一论啥都没有，第二论则是我刚说过的单引物扩增，300bp亮带，比我预期的小得多）。根据以上的描述，请各位多多指点，我现在做的很苦
