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标题:[求助]仰天长哭，PCR条件摸索

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发表于 2011-10-8 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]仰天长哭，PCR条件摸索

[求助]仰天长哭，PCR条件摸索


请各位大虾看看小弟的PCR有什么问题？
我要扩增一219bp的片段
用25微升的体系，Mg我一开始用的1.5mM，dNTP 0.1mM Taq 1 U
反应条件： 95 度 5 分
94 1 分， 56 度 50秒， 72度 50秒 35 循环
72 5分
于2% agarose gel 150V电泳
结果 有目的带，同时出现500bp 300bp 等多条杂带。

我将体系调整了，Mg 1.0mM 其余各项未变。
退火温度改为58 度，延伸时间改为40秒。
同样条件下电泳，结果没有太大的改变。
不知道这是什么原因?
请各位大虾帮帮小弟。
小弟感激不尽！！！！！！
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发表于 2011-10-8 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议你在用第一次的条件， 只是改变退火温度62再作一次， 延伸时间可以缩短到 20 s。 若还还是有杂带的话，温度再升高两度。
同时你可以看看引物设计有没有问题， 引物在末班上是不是有多个结合位点。
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发表于 2011-10-8 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为最好优化一下反应体系.先做梯度PCR,找到最适退火温度.若此时还不能解决你的问题的话,再做镁离子浓度的滴定(方法可参见各种有关PCR的书籍). 试试看
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发表于 2011-10-8 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的引物是通过primer 5.0设计的。评分还可以。只有一个错配。
然后还到pubmed上BLAST了一下。
自己感觉引物没有问题。
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发表于 2011-10-8 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
什么是模板？genomic DNA, cDNA , plasmid or linear gene.
出现这样的情况是够郁闷，放宽心，道亦有道。
建议：
1，减少循环次数；
2，增加退火温度2-3度；
3，genomic DNA,cDNA考虑模板的纯度与污染与否，重新纯化。
4，GC content of primer> 50%
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发表于 2011-10-8 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用cDNA做模板的。
还有一个问题就是杂带竟然比我的目的带还要亮。
My God!
都快要疯了！！！！！！
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发表于 2011-10-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的情况和你完全一样。我试过了模板梯度、镁离子浓度变化不大，现在只有提高退火温度了，退火温度甚至需要提高5度以上，继续干吧，有好消息也告诉我一下，谢了
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 小中大
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。
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发表于 2011-10-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR出现杂带原因是很复杂的，谁也没有工夫能通过实验证明你的PCR具体问题出在什么地方。

我建议：

变性时间不要这么长。复性也不要。延伸也不要。
都是30''就可以了，时间足够。30个循环应该够了。这样在一定程度上(其实很不显著)可以减少长片段的非特异性扩增。而且做起来还特别快
模板浓度不要太高

另外PCR不能解决的话，完全可以考虑以下方法：

切下胶上你需要的条带回收。
不要管那么多，先把条带克隆了再说，最后了不起测个序。
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发表于 2011-10-8 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看不到你的电泳图，不过出现非特异性条带，关键还是考虑下面几个方面
1、退火温度，这个可以采用梯度的方式选择。
2、引物，有可能是引物浓度过高，模版相对较少，如果电泳结果有较多的引物二聚体，可以降低引物浓度，当然，如果模版少的话，还可以略增加模版。
3、至于镁离子浓度，在一定的范围内，对特异性影响不是很大，不做主要的考虑。
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