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标题:[求助]大家看看我这种引物本身的缺陷怎么解决

雪原[使用道具]
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发表于 2011-10-8 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大家看看我这种引物本身的缺陷怎么解决

[求助]大家看看我这种引物本身的缺陷怎么解决


实验需要扩增一段人genome的序列，1000bp左右
但是上游引物基本是不能变动的，其中会有6个碱基由于连续的AATTAATT，导致自身二聚体的潜在可能，但是上游引物我不可能再改变序列了，必须用到这段结构特殊的序列。
昨天摸了一个gradient PCR，非常惨啊，从68度到55度都没有扩增出东西。

各位高手帮我出出招
如果不重新设计引物，我还能有什么好办法（否则，实验设计就全改了）

万分感谢！
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wiwi[使用道具]
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发表于 2011-10-8 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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发表于 2011-10-8 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用Hotstar酶

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热启动主要是用来消除非特异扩增，但是对于引物DIMER的情况好像不是太好吧

在负性的时候，引物一样会形成dimer的
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2011-10-8 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于没有引物二聚体扩增，所以即使形成二级结构的话也应该在5‘端，我觉得影响不会太大吧，你可以优化一下PCR条件。如果经费允许的话，可以尝试一下TaKaRa公司的single tube的一个试剂盒，大概900元，效果挺好的。也可以先去除这段特殊的序列，设计一个新的上游引物，PCR扩增出目的条带以后再用原引物扩增，这样似乎更好扩增一些。
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云端ing[使用道具]
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发表于 2011-10-8 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要是是我的话，就把引物搞长点做双温循环，才不管这许多。
还有上游引物为什么不能变呢？
AATTAATT是做啥的？
如果是密码子，换个吧碱基，只要不改变氨基酸就好。
应该不是转录调控元件吧，他们的位置要求不需要这么严格吧~~
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发表于 2011-10-8 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题不一定是引物二聚体的问题。一般A/T形成的二聚体都不强，影响可能不大，我觉得你的问题可能是A/T含量高，可以试试进一步降低煺火温度。
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缘yuan[使用道具]
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发表于 2011-10-8 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
觉得你扩不出来不一定是引物的问题，其实有的时候PCR对引物的要求并不高，我做过几次根本就不是设计的引物，基本都出了，而有的时候设计的引物反倒不出，所以我建议你重新设计下游引物再做，主要别有太多配对的就行了。
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雪原[使用道具]
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发表于 2011-10-8 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题不一定是引物二聚体的问题。一般A/T形成的二聚体都不强，影响可能不大，我觉得你的问题可能是A/T含量高，可以试试进一步降低煺火温度。

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多谢啊，现在扩出来了，主要是模板的问题，以前用的模板可能有降解
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雪原[使用道具]
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发表于 2011-10-8 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题不一定是引物二聚体的问题。一般A/T形成的二聚体都不强，影响可能不大，我觉得你的问题可能是A/T含量高，可以试试进一步降低煺火温度。

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多谢啊，现在扩出来了，主要是模板的问题，以前用的模板可能有降解
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