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PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：

附件

2016-1-5 15:56

27678778.snap.jpg (92.27 KB)

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发表于 2016-1-5 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：cuturl('http://primer3.ut.ee/')
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示

附件

2016-1-5 15:56

87040254.snap.jpg (54.15 KB)

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发表于 2016-1-5 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：

附件

2016-1-5 15:57

88625056.jpg (23.97 KB)

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发表于 2016-1-5 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

点击“Pick Primers”按钮

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2016-1-5 15:58

95311266.jpg (19.2 KB)

2016-1-5 15:58

23073642.snap.jpg (152.15 KB)

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发表于 2016-1-5 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准

附件

2016-1-5 15:58

85839439.snap.jpg (71.1 KB)

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发表于 2016-1-5 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

然后点击“Pick Primers”按钮

附件

2016-1-5 15:59

42984525.snap.jpg (164.53 KB)

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发表于 2016-1-5 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这样上游引物就可以使用了，即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT

yonger[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unacceptable GC content/Long poly-X，该怎么处理？
3、有的引物Tm too HIGH，该怎么处理？
望指导！谢谢！

PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yonger 于 2016-1-5 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unaccep ...

1、最多可以无限加
2、有时候受限于miR的序列无法设计成完美的引物，可以直接取miR序列做引物即可，不过要去掉外部与逆转录引物互补的7个碱基序列
3、加AT

wawa[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好！你这个帖子的茎环序列，我在你其他帖子中也看到了，想必你们实验室用该序列效果是挺好的了。请问你用该茎环做的是什么物种？

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