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标题:【求助】高GC含量PCR困难，求助

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发表于 2016-1-7 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】高GC含量PCR困难，求助

各位大虾：
本人PCR两月有余，尚无结果。
我的目的片段是SERT（5－HT转运体）基因的启动子区，要做多态性研究，该片段GC含量70％多，共500bp左右，我用的是TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II，总共扩出两次，余均未能扩出来。参看文献是用的同样的酶，请各位大虾帮忙分析一下，还有什么办法可试试！我用的PCR条件是按试剂盒说明书，退火温度用梯度摸出1次，因随后多次未成功，故重新再梯度均未做出来！模板是人的外周血基因组DNA。
急！
谢谢各位！
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发表于 2016-1-7 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以试着加点辅助剂,如甘油,四甲基桠枫.
good luck
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misswu61[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也准备批一个GC67%,530bp的基因。师兄做了几次，用的是TaKaRa的LATaq酶没带GC buffer的，令人难解的是他是在前10个循环50度退火，后32个循环53度退火的怪异条件下多次批出。当然代价就是许多非特异带。我也买了一支TaKaRa的LATaq酶带GC BufferI，II的，准备优化一下条件。非常理解dguagua的烦闷，不过我想你已经批出一次就应该有希望，加之我们的目的基因虽然GＣ高，但是片段小，总比那些被大片段高gc折磨的战友好些吧。对了，希望你把摸出的条件和体系附上，大家伙探讨一下，或许有办法！good luck
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发表于 2016-1-7 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加DMSO吧。我设计的一个片段370，CG74.5%。多次未能扩出，加DMSO 5%出来啦。同时提高退火温度和变性温度。祝你好运。
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发表于 2016-1-7 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中已加DMSO和甲酰胺等辅助试剂,并已经按体系优化,因此没有必要额外加DMSO.dguagua 战友所提到的共批了约50次，成功5次,可以肯定是模板质量不一致所至, 你可以比较你的模板质量.如果把模板浓度调一致,看是否可以得到改善? 对于PROMOTOR区的扩增, 由于高GC含量,可以尝试热启动, 降落PCR, 乃至更换引物. 类似发帖本版块很多,可以搜索一下
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发表于 2016-1-7 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
诸大虾，我想 TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中应该已加DMSO了吧，不过我会加点DMSO再试试。另外请教，目前共批了约50次，成功5次。同样的体系同样的条件，为何仅偶有成功，是否是因模版基因组不同的关系？但模版基因组采用宝生物试剂盒抽提，且每次都由电泳确认的。以下为体系及条件，请各位大虾提供宝贵意见，是否存在问题，需进一步调整：
水2.5－5ul
GCbuffer 1或2 12.5ul
dNTP 4ul
引物各 0.5ul
TaKaRa的LATaq酶 0.25ul
模版 5－2.5ul
总共25ul体系。
PCR：96C x 2min
94C x 30s
61.5C x 30s
72 C x 2min
72C x 10m
中间三步循环35次
每次PCR均有二聚体，成功的几次也有。引物按照文献设计，经NCBI确认符合。请指教！！谢谢！！
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发表于 2016-1-7 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中已加DMSO和甲酰胺等辅助试剂,并已经按体系优化,因此没有必要额外加DMSO.dguagua 战友所提到的共批了约50次，成功5次,可以肯定是模板质量不一致所至, 你可以比较你的模板质量.如果把模板浓度调一致,看是否可以得到改善? 对于PROMOTOR区的扩增, 由于高GC含量,可以尝试热启动, 降落PCR, 乃至更换引物. 类似发帖本版块很多,可以搜索一下
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发表于 2016-1-7 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我前几天用TaKaRa的LATaq酶GC BufferI做了一次,条件如下:
94 度 4分
94度 30秒
53度30秒
72度1分
2----4步35循环
72度5分
也是25微升的体系,加样总体和dguadua兄的差不多,模板只加了2微升。结果内参和目的基因均可见，当然有许多非特异带，我准备提高退火温度试试。我觉得楼主的退火温度似乎太高了，我的引物的Tm分别是67，69。可是鉴于我师兄的既往经验，设高Ta很难得到目的带。一点建议，请指正。
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 小中大

5% DMSO or 10% glycerol
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yayya[使用道具]
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 小中大

我用的也是LATAK和GC buffer,目的片段544bp，GC含量71％，扩增时效果非常理想。我采用的方法是第一步PCR20个循环，然后用此PCR产物做模板进行第二次PCR .dguagua 的反应体系中为什么dNTP加4ul？我每次都是加1ul，10pmol引物各加1ul。还有如果是基因组DNA做模板，变性温度可以提高到98度
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