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标题:【求助】请教目的基因多少bp

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发表于 2016-1-7 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教目的基因多少bp


各位路过的仁兄和大侠，我从一篇外文查到pubmed核酸编号为NM_012750的mRNA（Genbank提供详细序列见附件），参考文献，PCR引物设计为：
F: 5’-AGTT CTAT GAAG CTTC CCCC-3’
R: 5’-CACT CTTC TTCC ATGT TCCC-3’
由于文中未写出反应条件和目的基因大小，敢请诸位指导一二，究竟应该是多少bp?
万分感谢！
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发表于 2016-1-7 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

总长度应为643bp,见附件,两个红色的是引物序列,其中下游引物要简单处理一下,即写出其反向互补序列,然后再从word中查找!
祝 顺利!
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发表于 2016-1-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天跑了电泳，图片如下
从MARKER数起，靠近MARKER的两条就是slytjiaofei兄帮忙分析的目的基因的电泳结果
似乎原位不动？还是根本不是DNA条带？？
最右边的条带是非特异性条带么？我的目的基因位置理论位置为250bp,似乎隐约可见，但其他位置的条带更粗更亮，反应条件还是引物问题？请各位不吝赐教！
附注：MARKER从下往上依次对应：100bp、200、300、400、500、600、700bp......


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附件
2016-1-7 10:41
11043020.jpg (8.79 KB)
 
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发表于 2016-1-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

靠近MARKER的两条和你的目的条带均没有特异扩增产物,看来是需要在摸摸条件,建议作个梯度PCR,如果仅仅是PCR的话,用25ul体系就可以了,没必要用50ul的体系,退火温度从50-60度,每2度为一个梯度,另外酶可以换好一些的,如takara的ex Taq酶,最后就是模板DNA了,你可以用别人扩增效果不错的引物先做以一下,如果扩增效果好的话就可以排除模班的问题了.
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发表于 2016-1-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是RT-PCR，现已逆转录为cDNA，这几天对其进行PCR扩增。
引物是北京三博远志公司提供，Tm是57.8度，两条目的条带是分别是54度32循环、56度30循环
具体条件如下:
94度5min
94度45s
54(56)度30s
72度1min
30(32)循环
72度延伸10min
请问如果做梯度，以上条件有什么可以优化，能减少样本耗损是我要兼顾的
由于我做的是骨髓干细胞培养，样本量少，确实是个难题
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发表于 2016-1-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RT的体系一般都是20ul,你可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件.你给出的循环条件首先我认为延伸时间有些长,我感觉30-45秒足够了,因为基本上1kb对应延伸时间为1min,另外就是引物Tm值,其实不同软件计算出的数目相差很大,所以我还是建议你再摸摸退火温度!
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发表于 2016-1-7 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ALALA 于 2016-1-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

RT的体系一般都是20ul,你可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件.你给出的循环条件首先我认为延伸时间有些长,我感觉30-45秒足够了,因为基本上1kb对应延伸时间为1min,另外就是引物Tm值,其实不同软件计算出的数 ...

多谢多谢，看来我确实要摸摸条件才行
我用的是上海申能博彩生物科技有限公司的RT-PCR试剂盒，说明书用法：
RT是20ul系统没错，PCR给出的是50ul加样顺序和量
PCR要求加cDNA为1-5ul，我加的是4ulcDNA
“可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件”我不是很理解，脑子呆啊
您的意思是取10ulcDNA或者5ul稀释进行PCR扩增？好像太多了？
见笑了
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发表于 2016-1-7 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 泡泡 于 2016-1-7 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢多谢，看来我确实要摸摸条件才行
我用的是上海申能博彩生物科技有限公司的RT-PCR试剂盒，说明书用法：
RT是20ul系统没错，PCR给出的是50ul加样顺序和量
PCR要求加cDNA为1-5ul，我加的是4ulcDNA
“可以一分为二或取出1/4, ...

你的意思是让你稀释模板.比如你现在在用4ul,那么可以取4ulcDNA然后加入4ul无菌无酶双蒸水稀释再取4ul做,然后把剩余的再加入4ul双蒸水稀释,再取4ul作为模板.依次稀释.其实就是梯度稀释模板.
看了你的电泳图和PCR条件.
1.如果你非常信任那篇文献的话.退火温度得摸索,做大跨度的摸索,52~64度.每2度一管.
2.根据你的反转录试剂盒上的公式计算你的cDNA产量.然后确定模板量.不要盲目加模板.
为什么没有看到你P内参呢?那也可以大概估计你的模板加入量.
3.提高循环数试试,延伸72度1min的确有点长,终延伸10分钟可以不要.
4.检查下你的dNTP的质量,中间没有出孔的两道很像是dNTP失效后的PCR图.
继续交流联系!
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发表于 2016-1-7 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 @STAR@ 于 2016-1-7 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的意思是让你稀释模板.比如你现在在用4ul,那么可以取4ulcDNA然后加入4ul无菌无酶双蒸水稀释再取4ul做,然后把剩余的再加入4ul双蒸水稀释,再取4ul作为模板.依次稀释.其实就是梯度稀释模板.
看了你的电泳图和PCR条件 ...

谢谢你的解答！您说的如果我还是用50ul体系的话 ，可以采用梯度稀释模板法，真是个好主意！
因为说明书只说用1-4ul的cDNA并没有什么具体的量，也没有具体计算公式，郁闷！请问常用量是多少？（按20或者50ul体系算的话）
dNTP MIX 是 10mM的，50 ul体系用1ul，如果dNTP有问题，内参应该没有那么好－－
我内参做了，条带尚满意，见下图所示


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附件
2016-1-7 10:50
68515566.jpg (1.96 KB)
 
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发表于 2016-1-7 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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原帖由 泡泡 于 2016-1-7 10:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你的解答！您说的如果我还是用50ul体系的话 ，可以采用梯度稀释模板法，真是个好主意！
因为说明书只说用1-4ul的cDNA并没有什么具体的量，也没有具体计算公式，郁闷！请问常用量是多少？（按20或者50ul体系算的话）
dNTP MIX 是 10m ...

1.一般是反转录的时候用1ug的总RNA或(0.1ug mRNA),20ul反转录体系.然后在PCR时加入2~3ul模板cDNA即可.可以根据产物的量适当调整.
2.你的内参不错,挺好的.那么dNTP应该没问题.建议使用时dNTP稀释到2.5mM.加入4ul.比加入1ul的10mM的准确.
3.那么还是在退火温度,大概是RT中最重要的了.排除下引物的稀释时是否标准操作.
等再次做后把图发上来再一起分析.
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