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标题:[求助]不经纯化上次pcr产物做二次pcr总是失败，郁闷

wu11998866[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]不经纯化上次pcr产物做二次pcr总是失败，郁闷

[求助]不经纯化上次pcr产物做二次pcr总是失败，郁闷


各位大侠帮忙，
是什么原因，这么简单的东西都做不出来，
郁闷死了，
二次pcr结果弥散整个泳道
提高了退火温度也没有用
阳性对照（即一次pcr）却可以p出来
模板梯度实验没有一个浓度可以
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大桃子同学[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也曾经遇到过这种情况，首先你得肯定你第一次PCR的长度几乎和目的片段一致。
你可以这样实验一下：减少模板的用量减少循环次数；
或在agarose中切下你的目的片段-20度15分钟，然后离心取上清再取上清为模板，PCR；
如果还不行，就再设计一对稍长一些的引物，用新引物做第一次PCR，再用旧引物做第二次PCR（不是巢式PCR）。我就是这样成功的，我也不知道为什么这种办法能成功钓取基因。

以上是个人意见，仅供参考。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那要不要稀释呢？  
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lixi559[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做二次PCR，直接用PCR产物而不稀释再做，是不行，必然出现那种弥散的情况，因为相当于模板大大增多，这时模板（包括新扩增出来的）大大增多就导致了不仅退火的时候不仅与引物结合，而且自身也容易结合。这时非特异扩增程度大大增加，所以会出现弥散的一片。建议把产物稀释1000-10000倍再做二次PCR。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是如果第一次的pcr产物经过一轮凝胶回收之后，用作第二次prc的模板
不经过稀释，结果扩增成功。
因为我正在做改组（shuffling），所以片断重装以后形成的基因在凝胶上根本看不出来，更不用说回收了，所以要是有一个办法能够使得不经过纯化一次pcr产物就可以用作二次的模板，那么我的shuffling就有戏了。
各位扩展了我的思路，我会好好试一试的，谢谢
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我是一片云[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你第一次PCR的产物中有引物二聚体等非特异产物,直接用做模板,PCR会放大这种非特异,切胶回收的产物是比较纯的目的片段,所以就没有弥散的现象了
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
the second PCR should keep the cycles less than 30.

the template DNA (first PCR product) should dilute 100-1000 times.

You can design the nest primers for the second PCR. Just one primer from nest is enough.
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麻瓜[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们经常采用的方法是将你的第一次扩增产物约20－40微升全部上样跑PAGE，然后将你的目的片断切下（或者先干胶到滤纸上，再拿剪刀剪下你的目的片断），泡到纯水中或者1倍的TE中，37摄氏度36h后就可以按照常规PCR来做了，基本不用稀释，20微升体系里，加1到2微升足够。
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蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为是做shuffling，个人觉得稀释第一次PCR的产物可以试一试
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七彩星星[使用道具]
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发表于 2011-10-9 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
改组中，重聚本来就是很难的。序列被消化成小片段后，在扩增时不同模板序列的寡核苷酸是互为引物，把循环次数增加，退火温度比常规PCR略低即可。
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