[求助]共同分析PCR结果——如何摸条件!

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标题:[求助]共同分析PCR结果——如何摸条件!

smile_smile[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]共同分析PCR结果——如何摸条件!

各位仁兄，有很多人问如何摸PCR条件，下面把我最近做的拿出来做个例子，希望大家踊跃参与。有益者请版主加分。我用RT-PCR扩增目的基因，cDNA是几天前合成的，PCR条件如下：cDNA 3μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
Taq酶 3μl
Taq buffer 5μl
DNTPs(10M) 1μl
加水至50μl
94ºc 5m
94ºc 30s
57ºc 30s
72ºc 45s
35 cycles
72ºc 10m
PCR结束后立即电泳，1.5%琼脂糖，50V 1小时
可以看到，Marker明显分出条带（第一泳道），第二条泳道条带较弱，第三条更不清晰，第四条为内参还算可以。大家帮我出出招，怎么改进反应体系，使扩增更完美，谢谢！

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2011-10-9 10:06

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969[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DNTPs(10M) 1μl 是否正确
Taq酶 3μl 是否太多
加水至50μl 是否是新制备的

969[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DNTPs(10M) 1μl 是否正确
Taq酶 3μl 是否太多
加水至50μl 是否是新制备的

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. cDNA用量我想不用那么多也可以，要根据自己反转录时的体系和所加入的RNA量来判断，避免浪费。
2. DNTPs(10M) 1μl：写错了！应该是10mM。嘻嘻，楼主笔误。1μl少了点吧，如果是50μl体系，应该是4μl比较合适。
3. 引物浓度应该告知，因为虽然引物浓度一般大家都是比较固定的，但是每个人的习惯不同。做RT有时这也是影响因素的。
4. 还有Taq酶的浓度太高了。
5. 我看既然已经可以P出来东西，就说明最基本的条件还是可以的，只不过要改进一些。退火时间改为1 min，延伸时间改为2 min试试看。
6. 还有就是如果其他条件都改变了，也没有什么改善可以试着用不含有Mg离子的buffer，自己调一下Mg离子浓度。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的意见：
1.CDNA不要减，如果扩增条带很强的话，可以减，现在扩增并不是很理想，不要急于节约。
2.酶的浓度确实太高了，有1u/反应足以，太浪费了。
3.DNTP加1UL足够了，如果是10mM的初浓度。不要忘了CDNA中还有不少的DNTP，我们在RT时一般DNTP都过量了很多，在PCR时其实不加DNTP也是可以的。
4.不妨退火温度降低到52~55，延伸时间不动也可以，或者加到1MIN。
5.看你的目的带应该是在400BP左右，电泳80~100V，30MIN，减少扩散。
6.可以补加点Mg离子。

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想94ºc 5m大可不必，以为你是以CDNA为模板，而不是DNA，你的酶竟然用3UL，如果是好酶，用量要减办，如果为国产，建议更换！还可以在反映体系中加入一些促进剂，如DTT，甜菜碱等。实在不行做二次PCR。

smile_smile[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家的讨论.在此更正一下：
1. DNTPs(10M) 1μl，实在是笔误。10mM,嘻嘻，写完忘检查了
2。cDNA的量可能是不够。
3.taq酶3μl是3U的。
4.引物浓度30pmol/μl
4.加水至50μl使用的是DEPC处理水。
5.其他的象退火温度，Mg的浓度，延伸时间同意大家的意见。

还有什么建议请指出。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

几点建议：
1、cDNA的量可以测一下；
2、退火温度要依据 Tm值确定，并优化；
3、Mg离子浓度适当优化；
4、延伸温度应根据PCR产物长度确定。
再试试，你好象是用一个条件在扩增多个产物吧。这就更需要优化和摸条件了。

smile_smile[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如何确定退火温度呢？我知道Tm值。怎样优化？
今天重做了RT-PCR效果还没有上面的好。
我的PCR产物是400bp的。只扩增一个目的片断。

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-10-9 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

几点建议:
1.我觉得酶的量太高!,我使用的是Takara的Ex Taq,通常50ul体系只加一个单位;
2.模板的浓度应该定量一下;
3.如果有梯度PCR仪可以优化一下Tm,但从你的电泳结果来看,估计变化不会很大;
4.目的片段不是很大,所以个人认为退火和延伸的时间基本可以不变;

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