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标题:【求助】关于贴壁细胞LDH的检测

孢子11[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于贴壁细胞LDH的检测


有个问题想不明白，LDH本身是细胞浆内存在的一种酶，当细胞膜受到损伤时被释放出来，对于贴壁细胞就可以通过测上清中LDH的量来评估细胞受损的程度，那为什么很多研究者通过TRITON破膜来测细胞总LHD呢？这样有什么意义？还是通过上清LDH/总LDH来评估细胞受损程度？
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园丁##[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase ,LDH）是存在于细胞浆内的一种酶，乳酸脱氢酶在生命体中糖代谢中扮演重要角色。
在我们培养的细胞中乳酸脱氢酶分别存在于以下三个地方：
1、存在于活细胞内。若你培养的是贴壁细胞(viable adherent cells)，那么贴在壁上的就是活细胞，此时的乳酸脱氢酶就存在于细胞内，所以测得贴壁细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）活力就代表培养细胞中活细胞的量，我们称之为LDHV。
2、存在于漂浮于培养液中的凋亡小体(Apoptotic bodies)。由于凋亡小体有细胞膜，因此凋亡小体中的乳酸脱氢酶也没有释放到胞外。此时测得凋亡小体中的乳酸脱氢酶（LDH）活力就代表培养细胞中凋亡细胞(apoptotic cell)的量，我们称之为LDHa。
3、存在于培养液中。坏死的细胞(Necrosis)胞膜破裂乳酸脱氢酶释放，分布于培养液中, 此时测得培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力就代表培养细胞中坏死细胞(necrotic cell)的量，我们称之为LDHn。
那么我们就可以计算细胞中凋亡或坏死的比率来衡量细胞损伤的程度。
凋亡% = LDHa/(LDHa+LDHn+LDHv) × 100
坏死% = LDHn/(LDHa+LDHn+LDHv) × 100
死亡% = (LDHa +LDHn)/(LDHa+LDHn+LDHv) × 100
其中(LDHa+LDHn+LDHv)代表细胞总LHD。
因为即使我们每次埋板的细胞数相同，但是由于细胞生长受多方面影响，所得的细胞数量也不一样，所以每次测得胞内和胞外乳酸脱氢酶的量都会不一样，所以不能单纯通过测上清中LDH的量或测细胞总LHD来评估细胞受损的程度，而通过上清LDH/总LDH的比率来评估细胞受损程度是比较符合实际。
另附简要操作：吸取细胞培养瓶中液体置离心管中离心，离心后沉淀于管底的是凋亡小体，上清液中的就是坏死细胞的LDH,将凋亡小体和贴附于培养瓶壁上的细胞破膜即可测定凋亡小体和活细胞的LDH.
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发表于 2016-1-12 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这样的，我查了一些文献，也是这样计算的。但我用的是建成的试剂盒，我不清楚我要用多少上清检测，我上次做了一次预实验，50ul上清，100ul细胞裂解液裂解帖壁细胞，但结果不是太好。
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发表于 2016-1-12 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

搭车急问:裂解细胞的tritonX-100的终浓度应该是多少比较合适?
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koook5695[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室是用1% NP40裂解。至于tritonX-100的浓度你可以找几篇文献看看。
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孢子11[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

tritonX-100的浓度是0.2%
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yysr238[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
,用南建的试剂盒能检测出来吗?好象它多用来测组织和血清中LDH,酶活力大,都几千U的.而细胞培养的酶含量少,只有几十U(文献报道).我想知道你检测的结果各组有差异吗?大概用多大的细胞量?谢谢,请回复啊Smile
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yysr238[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在做细胞缺氧复氧损伤模型时也要做以上几个LDH检测吗?我看到的文献中都是只测培养上清中的LDH漏出率的,这样是不是不够准呢?还有如果南建的盒子测不出来的话,你 还知道什么可行而比较经济的方法吗?好象有一种直接用酶标仪490NM下检测LDH的方法不知有没有听过啊???
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我今天又做了一次，用的是24孔版，105次细胞吧。因为96孔板裂解细胞不好操作，孔太小了。我看文献也有人用24孔板做的。50ul上清，50ul细胞裂解液，让我奇怪的是，按那个公式，就是上清/上清+细胞，我得到的结果是反的。模型组的漏出率比正常组的低。我上次也是这样的结果。我准备再做，这次细胞的上清培养体系。
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发表于 2016-1-12 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
让我奇怪的是，按那个公式，就是上清/上清+细胞，我得到的结果是反的。模型组的漏出率比正常组的低。我上次也是这样的结果。我准备再做，这次细胞的上清培养体系。

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我做的也有这种问题.
我觉得正常对照组\损伤模型组\损伤+给药组释放的LDH测到的损伤程度不如相应的MTT差距大.比如我的损伤模型组按MTT数据看,损伤率在50%,但是LDH检测结果用上清/裂解细胞,得到的损伤只有20%.
我发现不少文献不用裂解细胞的方法计算损伤程度,只和正常对照组的LDH释放量比较,以正常对照组释放量为100%计算,一般损伤模型组也就在200%左右,加药保护组在100%-150%左右.这说明LDH的释放的范围其实还是比较窄的,对检测的灵敏度要求就高.搞得不好,保护组数据就靠到损伤组那边去了.
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