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标题:【求助】小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法

龙小好汉[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法


如果不加刺激物质，能不能提取到足够多的小鼠腹腔内巨噬细胞，有没有好的建议。
不加刺激物质时，我提取过很多次小鼠腹腔巨噬细胞了，但结果总是不稳定，有时提取多，有时提不出，请问哪位老师或同学做过该实验。
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过小鼠腹腔巨噬细胞提取，而且还查过大量的这方面的实验资料。
总结如下：
第一：用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2ML。实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2---3MIN，消毒皮肤。于无菌环境下向腹腔注入HANKS液8ML，用手轻轻挤压腹壁20次以上，吸出灌洗液。将灌洗液离心2000R/MIN，5MIN，弃去上清，用HANKS洗涤3次，合并小鼠细胞，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，记数，调整腹腔细胞浓度为2*10*6/ML，将腹腔细胞加入24孔培养板中，1ML/孔，于37摄氏度，5%CO2培养箱中培养3--4小时，使巨噬细胞贴壁，取出培养板 ，弃去上清夜，用HANKS也反复吹洗培养孔3遍，除去非粘附细胞，即为巨噬细胞单层
这里是加刺激物质的小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法。绝对真实！
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第二种：
不加刺激物质的提取方法：
1 实验结束后，拉颈处死小鼠，用75%酒精消毒。
2 用带9号针头的5ML注射器腹腔注入含75%小牛血清的HANKS液（5%NBS---HBSS）
轻柔腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞0，反复抽吸几次。
3 1500 R/MIN 离心 8MIN， 用5%NBS---HBSS洗2次。
4 将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液（10%NBS---1640）配成2*10#6/ML
加到24孔平底培养板中，1ML/孔，5% CO2 温箱孵育2H
5 每孔用5%NBS---HBSS洗3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层
绝对真实，绝对原文，绝对独家
见《免疫学常用实验方法》应该是这一本书，2001出版的
我这里只有我的论文，是从那里选取的，本人就是大体按照这个文献作的
并且略做改动
下一次说说自己作这个实验的经验
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2016-1-12 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

自己作这个实验时，考虑了方方面面的问题。
当时我作的实验小鼠分为四组，因为涉及细胞培养，所以要求无菌操作，自己小心又小心，到最后还是有一组污染了。但是成功了3组，应该说还是不错的，当时我还需要取血，及脑组织。现总结如下，希望对大家能有所帮助。
第一：因为要求无菌操作，所以取腹腔细胞的时候，尽量在无菌造作台上进行。无菌操作台事先要消毒
第二：为避免交叉感染，，每一只小鼠我只用一个针头，为了节约我只买了4个注射器
只换针头即可！！
第三：事先我也想到了，如果有的小鼠即便注射了5%小牛血清HANKS，在抽取的时候 也未必能抽出液体，因此事先准备了开腹的手术器材；刀子，镊子等，事先一定要高温消毒。正式实验时，有的小鼠真的没有取出液体，然后我就开腹腔了。这一步一定要注意操作，要有无菌意识
我按着文献作的时候，基本上还可以
最后都取出来了
只是有一点可惜：其中一瓶感染了，
说实话：我培养的时间大约2天，最后只有一瓶感染。
自我感觉只要注意好操作
注意无菌意识应该没有问题
绝对原作呀
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finger[使用道具]
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发表于 2016-1-12 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们都直接去饲养细胞，你用什么刺激物！请赐教！
我们都是处死取得！你们呢？
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iii_ii[使用道具]
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发表于 2016-1-12 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验时，我们是先用淀粉肉汤（好像是6％）腹腔注射，不知你的实验可否借鉴
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小葵[使用道具]
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发表于 2016-1-12 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小鼠一般选成年雄鼠，取之前饥饿8小时以上，取得的细胞较多，活力也较强。
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2016-1-12 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过小鼠腹腔巨噬细胞提取，而且还查过大量的这方面的实验资料。
总结如下：
第一：用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2ML。实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2---3MIN，消毒皮肤。于无菌环境下向腹腔注入HANKS液8ML，用手轻轻挤压腹壁20次以上，吸出灌洗液。将灌洗液离心2000R/MIN，5MIN，弃去上清，用HANKS洗涤3次，合并小鼠细胞，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，记数，调整腹腔细胞浓度为2*10*6/ML，将腹腔细胞加入24孔培养板中，1ML/孔，于37摄氏度，5%CO2培养箱中培养3--4小时，使巨噬细胞贴壁，取出培养板 ，弃去上清夜，用HANKS也反复吹洗培养孔3遍，除去非粘附细胞，即为巨噬细胞单层
这里是加刺激物质的小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法。绝对真实！
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发表于 2016-1-12 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第二种：
不加刺激物质的提取方法：
1 实验结束后，拉颈处死小鼠，用75%酒精消毒。
2 用带9号针头的5ML注射器腹腔注入含75%小牛血清的HANKS液（5%NBS---HBSS）
轻柔腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞0，反复抽吸几次。
3 1500 R/MIN 离心 8MIN， 用5%NBS---HBSS洗2次。
4 将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液（10%NBS---1640）配成2*10#6/ML
加到24孔平底培养板中，1ML/孔，5% CO2 温箱孵育2H
5 每孔用5%NBS---HBSS洗3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层
绝对真实，绝对原文，绝对独家
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我这里只有我的论文，是从那里选取的，本人就是大体按照这个文献作的
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2016-1-12 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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自己作这个实验时，考虑了方方面面的问题。
当时我作的实验小鼠分为四组，因为涉及细胞培养，所以要求无菌操作，自己小心又小心，到最后还是有一组污染了。但是成功了3组，应该说还是不错的，当时我还需要取血，及脑组织。现总结如下，希望对大家能有所帮助。
第一：因为要求无菌操作，所以取腹腔细胞的时候，尽量在无菌造作台上进行。无菌操作台事先要消毒
第二：为避免交叉感染，，每一只小鼠我只用一个针头，为了节约我只买了4个注射器
只换针头即可！！
第三：事先我也想到了，如果有的小鼠即便注射了5%小牛血清HANKS，在抽取的时候 也未必能抽出液体，因此事先准备了开腹的手术器材；刀子，镊子等，事先一定要高温消毒。正式实验时，有的小鼠真的没有取出液体，然后我就开腹腔了。这一步一定要注意操作，要有无菌意识
我按着文献作的时候，基本上还可以
最后都取出来了
只是有一点可惜：其中一瓶感染了，
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自我感觉只要注意好操作
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