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标题:【求助】关于Annexin V-FITC和PI双染流式检测方法

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发表于 2016-1-12 19:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于Annexin V-FITC和PI双染流式检测方法


我要使用Annexin V-FITC和PI双染的流式检测，需要送到我们医院的流式实验室去由他们做。可是他们没有做过Annexin V-FITC的，只做过PI单染的。
1、不知道这样双染和只有PI 的有什么差别吗？
2、在送检时对标本的量要求多少？
3、结果如何分析？是否要做二倍体（这是什么？说明什么？）分析？
我的同学里目前还不知有谁也做这个的，所以找不到人请教，还请各位大侠赐教！！多谢！
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发表于 2016-1-12 19:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面是两种染色的原理：
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法
1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
注意事项
1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
以上来自丁香园。具体你再搜搜看。另外你这种情况以前我们实验室有人做过，我最近也要去做，去医院让她们做。在微生物学技术讨论版里也有相关内容。
祝你好运！
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发表于 2016-1-12 19:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

网站里搜索一下，可以搜到一些的。
以前我做过一些，大致如下：细胞要活的，不能固定，你可以用宝赛的试剂盒(电话是是82020225，我刚好也打算做了，身边就放了一张名片)，里面有详细的说明。有些记不情了，细胞是消化下来后，直接加上两种荧光染料，孵育，离心洗去多余的染料，然后上机检测，因为是活的细胞，尽量做到随做随测。结果计算凋亡细胞、死细胞、活细胞的比例或者个数就可以了。它分为四个象限，每个象限代表的不一样，具体意义，你在这个版块中可以搜索到的。祝你成功。
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发表于 2016-1-12 19:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面是两种染色的原理：
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法
1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
注意事项
1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
以上来自丁香园。具体你再搜搜看。另外你这种情况以前我们实验室有人做过，我最近也要去做，去医院让她们做。在微生物学技术讨论版里也有相关内容。
祝你好运！
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发表于 2016-1-12 19:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

晶美代理benderAnnexin V-FITC试剂盒
目 录 号： LHK601-100
储存温度： 2-8℃
规 格： 100 Tests
有 效 期： 见外包装盒
试剂盒组份
1、结合缓冲液 4x (Binding Buffer 4x)
体积：20ml（4倍浓缩液）
稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2
2、碘化丙锭溶液 （Propidium Iodide）
体积： 1.0ml
浓度：20ug/ml
3、重组人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)
来 源：大肠杆菌（E.coli）
分 子 量：35.8 KDa
样 品 量：0.5ml，可用于100次实验
保存方法：于50mM TRIS, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保存
纯 度：SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%
生物活性：Annexin V可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性
应 用：
标记的Annexin V可结合流式细胞仪用于检测细胞外膜上的磷酯酰丝氨酸，操作流程如下：
1、  用去离子水按1:4稀释结合缓冲液（20ml结合缓冲液+60ml去离子水）；
2、  PBS充分洗细胞，取总数约为5-12.5×104的细胞待测；
3、  用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为2-5×105/ml；
4、  取195ul的细胞悬液加入5ul Annexin V/FITC;
5、  混匀后于室温避光孵育10分钟；
6、  用190ul的结合缓冲液洗细胞一次；
7、  用190ul的结合缓冲液重新悬浮细胞；
8、  加入10ul 20ug/ml的碘化丙锭溶液（终浓度为：1ug/ml）;
9、  流式细胞仪（FACS）分析.
实际应用时和使用单位的具体用法有关，最好先去和医院fcm操作者联系一下，核实细胞数、加染色剂的时间以及其他特殊要求。
操作者一般都会给出分析结果。具体也可以和操作者联系，可以详细询问，这里不罗嗦。
至于原理，到处有介绍，网上，凋亡相关的书籍里都有，祝好运
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 小中大

多谢楼上各位大侠的指点，我 用的 就是晶美的产品，就我 个人的操作这方面已请教了许多人。仅看产品说明书上的操作步骤还是不行的，不够细。比如最基本的是在冰浴中操作就没有提到。但是现在我的麻烦在于流式细胞仪的操作者不知道双染和PI单染的操作有什么差别，所以不愿意给我作－－－－真是头痛啊。我也在丁香园里搜索过了，没有看到我想了解的，所以希望各位能给点提示。多谢啦！
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 小中大

那你不可以换个地方做吗？你在什么地方？
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发表于 2016-1-12 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

单染和双染在使用流式细胞仪时的区别在于双染时需调整两种染料间的补偿,不过着需要一定的经验,你最好还是找有经验的人做吧
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发表于 2016-1-12 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

the difference between single staining and dual stain in annexin v analysis lies on the precision of the results you obtained and,as mentioned above,you must do a complex compensation in dual staining.but any experienced flow cytometry staff has no problem in doing so.
as to your issue,i think it's not you but the flow cytomerty staff to think of this tenichological stuff.if he have not such know-how of setting flow cytometer's compensation and still have interests i'd like to give some start informations.
and good luck.
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 小中大

谢谢大家,我请教了精美的技术人员,确实就如楼上战友说的那样,需要调补偿,也就是图象所在象限的调节吧.还是再谢谢楼上各位!!
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