【求助】关于胰酶消化步骤

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标题:【求助】关于胰酶消化步骤

abc816[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问这样用胰酶消化细胞比较规范

greenbee[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打

XYZQ[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 greenbee 于 2016-1-12 20:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打 ...

这位同学的就不要照着做了。不能消化至漂起来，只要显微镜下看到细胞变圆就可以了，如果都漂起来的话，可能就消化过度而且在弃掉胰酶时细胞全都会随胰酶丢失。
一般方法（适用于绝大部分贴壁细胞），以T25cm2为例：
1、弃掉原培养基
2、加入PBS（如果是原代细胞最好加Hanks液）洗涤3遍
3、加入1ml胰酶消化，至细胞变圆
4、加入含血清培养基（3－5ml均可以）终止胰酶消化
5、吹打成细胞悬液
6、将悬液接种至传代的容器中或者弃掉（比例可自行调整）
补充说明：消化时间，受室温和细胞贴壁性影响很大。你需要根据你的细胞进行摸索，最先开始消化的时候一定要在显微镜下连续观察，避免消化过度，有的细胞可能1分钟就可以了，有的则需要10分钟。自己看情况掌握吧。以后养的时间长了就明白其中道理了。祝试验顺利！

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 将培养液倒干净
2 我的习惯是加一些PBS轻轻冲洗细胞，后加入胰酶，不需要太多，只要铺满瓶底就可以
3 在台子里对着光看到有裂纹就可以加入PBS中和胰酶
4 用滴管吹打，将瓶壁细胞吹下来，贴壁紧的就多吹打几下
5 将细胞悬液加入离心管内，800转/分，5min
6 倒掉上清液，滴加约2ml培养液，吹打均
7 将细胞悬液根据实验要求加入细胞瓶中，盖好盖子，标记号，放进孵育箱

uaubc[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这样是那样？
1般我们是，倒干净培养液，加5毫升缓冲液轻涮1下，倒去缓冲液，加胰酶（不含EDTA的可直接加培养液，含EDTA的稍早倒去胰酶，静止2，3分钟加培养液）。

dmg[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mybioon[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

胰酶消化细胞比较规范的步骤：
1、吸去培养基
2、用缓冲液（不含钙镁离子）洗一遍
3、加入适当量的胰酶在37度消化3~5min
4、将胰酶和细胞的混合液移到15ml离心管1000rpm离心5min，去上清液
5、用新鲜的培养基轻微吹匀细胞，传到新的dish中

ha111[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充一点，消化时间不能太长，看到有细胞从瓶壁脱落就可以停止消化了。
一般一分半钟就可以了，消化完加入适量培养基，用滴管把细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，吹打同时也有助于细胞的分散。
然后转移到离心管中，600rpm，3min足够把细胞收集起来

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发表于 2016-1-12 20:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

lagua123[使用道具]
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发表于 2016-1-12 20:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离心不好吧，国外都是直接弃培养液，拍打然后加培养基

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