小中大实验步骤
水合氯醛麻醉大鼠,取腹部中线打开腹腔,腹主动脉放血,取出肾脏。
放入有D-Hanks液的小烧杯里,并用D-Hanks液冲洗,去除血细胞,之后放入平面皿里,去除肾盂和肾包膜,剪开肾脏,用小刀片刮出肾皮质。
把肾皮质转移到干净小烧杯里,用眼科剪剪碎,以1mm3大小为度。
加入少量的D-Hanks液,放到重叠的2层不锈钢筛网上,用注射器针头轻碾组织,同时用D-Hanks液冲洗,一直碾到组织发白即可。
用D-Hanks液冲洗200目上的筛网组织,使其转移至干净的平面皿里,再用移液管转移到10ml离心管里。
低速离心组织五分钟、1000r/min。用移液管(吸管或枪)去除上清液,加入0.1%Ⅳ胶原酶3ml,消化时间大概20-30min,边消化边观察(吸取少量的细胞悬液放在细胞计数板上用显微镜下观察,显示肾小球轻度破碎及松动即可),以肾小球散出但又不破碎为宜。
用20%FCS的DMEM终止消化,可用移液管(吸管或枪)吹打,再迅速离心五分钟,1000r/min。再滴加少许DMEM重悬。
重悬细胞液,用20ul枪头滴加到25ml的培养瓶瓶底(大约1-2滴)。然后向不同方向轻轻晃动培养瓶使肾小球悬液均匀种植在瓶底,然后迅速翻转培养瓶使培养面朝上,并轻轻晃动使细胞悬液分布均匀。
用注射器加入5mlDMEM至培养瓶中,放入培养箱中静置。
过3.5h后轻轻倒转培养瓶,使培养面朝下。四天内勿动培养瓶,第五天换液。可采用半量换液法,即用移液管弃去一半的旧培养液,加入适量新的培养液,目的是给细胞适应环境,在前一两次可采用这种方法。约2周上皮细胞接近长满瓶底,加入嘌呤霉素核苷( 5 mg/L )作用12 h选择性抑制上皮细胞生长。直至约4周时GMC布满培养瓶再进行转种。