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标题:[求助]菜鸟提问：细胞抽提RNA

wiwi[使用道具]
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发表于 2011-10-10 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]菜鸟提问：细胞抽提RNA

[求助]菜鸟提问：细胞抽提RNA


培养板上的细胞进行抽提，加入异丙醇离心后沉淀肉眼一点都看不出来，弃上清时分寸难以把握，感觉吸干上清后什么都没留下了。

是不是我细胞太少的缘故？可是6孔板张满不是至少有2.5×10^6个细胞吗？

还是我抽提有问题？可也只是到这步而已啊。

请指教
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发表于 2011-10-10 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般能看得见的沉淀要超过2ug了
看不见沉淀,小心一点操作,还是可以做下去的
不过如果真的象你所说的那样,10^6细胞得到的RNA就太少了
你用的什么方法抽提的?应该是TRIzol吧,用什么方法破碎细胞的?充分吗?
另外样品中加入糖原可以适当提高RNA的产率
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发表于 2011-10-10 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是用TRIZOL的，每孔1ml，可是我师姐说500ul就够了，和说明书上不一样，我也问不出个所以然来。加TRizol后就反复吹打直到粘粘的啊，大概3分钟样子吧，然后就加氯仿了。

谢谢，加糖原似乎比较麻烦啊
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发表于 2011-10-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入异丙醇后离心需12000转，20min。TRIZOL加多加少没大关系，主要为了去除蛋白质。  
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发表于 2011-10-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞的我没做过，我只做过组织，每100mg组织加1ml的TRIzol，我看说明书上是每5X10^6细胞用1mlTRIzol的
师兄们500ul、250ulTRIzol都用过，要看你做什么用了，做一次RT-PCR250ul足够了，1ml抽的RNA够过好多次Northern了  
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发表于 2011-10-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那我一孔加500ul确实是够了？？
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发表于 2011-10-10 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
六孔板每孔加0.5ml的确足够了。
离心的时候注意EP管的方向一致，吸头不要碰到RNA可能沉淀的地方。
把培养液倒干净，直接加入TRIZOL消化细胞就行。
做实验要有自信心！
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发表于 2011-10-10 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“TRIZOL加多加少没大关系” 我不太同意这个观点。可以看看TRIZOL说明书上的Trouble shooting，TRIZOL加少了会使提出来的RNA有DNA和蛋白污染的。一般35mm的培养皿培养的长满的细胞要加1ml的TRIZOL.
肉眼没看到就不一定没有RNA，在离心时最好形成习惯，就是将离心关的盖子的开盖的一边朝里，这样离心完后，沉淀就贴在后壁上，既使肉眼看不到沉淀，也能知道大体就在什么位置，倒上清时小心一点，或者用枪头吸上清，注意不要让枪头碰到沉淀的位置。我带本科生弟弟时进实验室第一件事就是告诉他这个。我觉得这是个好习惯。  
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发表于 2011-10-10 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我来说几句：
trizol 需要1毫升，不要太节省，否则容易引起讲解！
看不见很正常；不过应该可以看见，我用六孔板提过。
异丙醇10分钟即可。
RT 加RNA 1-2ug即可。PCR jia 1/40即可  
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2011-10-10 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"反复吹打直到粘粘的"
如果是粘粘的，就说明没吹打充分，DNA没被吹碎就很粘，与蛋白混在一起影响后面的氯仿分相，取上层水相时易吸到DNA和蛋白。如果吹打难以使其“不粘”，应使用研磨器，总之TRIZOL裂解这一步一定要充分，否则后面步骤再注意都徒劳。  
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