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标题:[求助]质粒稳定性问题

云端ing[使用道具]
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发表于 2011-10-11 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]质粒稳定性问题

[求助]质粒稳定性问题


最近在做荧光定量PCR，选用的标准品是质粒，刚刚稀释的质粒浓度梯度在PCR扩增曲线上显示良好的，梯度之间相差3-4个CT，但是在4度或-20度下放置几天之后，扩增曲线显示梯度之间CT相差较大，请教各位同行能否提供一些意见，谢谢！  
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-11 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用含rRNA或tRNA的溶液稀释质粒标准品可增加其稳定性。前者时liumeng主任推荐并使用的，后者是我自己使用的，效果很好。
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发表于 2011-10-11 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但我想知道原理，为什么能够增强其稳定性，并且RNA的浓度是多少，另外我想问一下，您是否也做荧光定量PCR这一块内容呢，以后有机会多交流。
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发表于 2011-10-11 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用到30ug/ml，你可以参考一下下面的帖子

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=409652&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#409652')
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发表于 2011-10-11 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超好，这可是参考书上很难见到的啊，奇招，妙招！有机会一定实践一下。
换个角度，有没有理论上讲的通的好方法，做相关内容的战友们不妨动动脑筋。对于质粒做标准品，尽量减少差异，-20融化，尽快用完，某些东西可以忽略的。
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发表于 2011-10-11 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是有质粒的纯度造成的，使得有双链DNA存在，而dsDNA是不稳定的。
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发表于 2011-10-11 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最初怀疑是质粒内部均一性的问题，因为经过质粒抽提后溶液里面主要是超螺旋DNA，也有少量的开环双链DNA，当然也可能有微量的RNA，随着放置时间的增长，会有部分超螺旋DNA转变为双链DNA，而双链DNA和超螺旋DNA的扩增效率是不一样的，从而导致各个梯度间的不稳，因此我用限制性内切酶酶切，切成线形，但结果显示还是同以前类似，主要是低浓度CT值推后
另外我想问一下，稀释用的tRNA或rRNA是不是什么物种的都可以？是自己实验室抽提的还是去试剂公司购买的？如果是外部公司购买
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发表于 2011-10-11 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最初怀疑是质粒内部均一性的问题，因为经过质粒抽提后溶液里面主要是超螺旋DNA，也有少量的开环双链DNA，当然也可能有微量的RNA，随着放置时间的增长，会有部分超螺旋DNA转变为双链DNA，而双链DNA和超螺旋DNA的扩增效率是不一样的，从而导致各个梯度间的不稳，因此我用限制性内切酶酶切，切成线形，但结果显示还是同以前类似，主要是低浓度CT值推后
另外我想问一下，稀释用的tRNA或rRNA是不是什么物种的都可以？是自己实验室抽提的还是去试剂公司购买的？如果是外部公司购买，请问是什么公司？非常感谢！
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发表于 2011-10-11 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
具体的原因不很清楚，用水溶解质粒，稳定性最差。如果不能用tRNA或者rRNA,至少应该用TE一类的有一定离子浓度的盐溶液稀释保存。我当时取了巧，不想用自己配制的TE，怕纯度不够，也不想再专门购买成品，就用了QIAGEN的质粒提取试剂盒中的EB溶液（在该试剂盒中是用来洗脱质粒的），我的质粒标准品如此保存的，置于4度，1个月内使用稳定性还不错。

我现在用的tRNA是酵母tRNA，ROCHE和invitro有售。
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云端ing[使用道具]
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 小中大
我前几天问了上海的几家试剂公司，他们都没有现成的核酸出售，好的，我去您说的几家公司去购买。
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