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标题:[求助]关于始终存在的非特异扩增

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发表于 2011-10-11 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于始终存在的非特异扩增

[求助]关于始终存在的非特异扩增


大家好！我有一头疼的问题。我的目的片段210bp,但我无论是提高退火温度，还是改变引物量，模板量，酶量或延长延伸时间，都始终存在一约110bp大小的固定非特异片段。而我的引物经过比对绝对没问题。最初的反应详情如下： 反应体系：总体积20ul, 模板DNA:4ul, 10×Baffer: 2ul, Taq polymerase(2.5U/ul):0.4,引物（5uM）:2ul, dNTP(2.5mM):1.6ul, Mg2+(25mM):1.2ul,10×Baffer: Tris-HCL:20mM, KCL:20mM,反应条件：94 ℃ 5分钟，94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃ 10分钟。希望大家帮忙分析一下，再提些建议，谢谢！
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发表于 2011-10-11 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的模板DNA是什么的DNA？
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 小中大
你的模板DNA是什么的DNA？
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发表于 2011-10-11 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Taq酶的反应速率约为1kb/min,所以你可以缩短退火时间和延伸时间,另外可以降低引物的浓度,0.2pmol/ul可以试试
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 小中大
我的模板是人的基因组DNA,用chelex-100提取的.
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发表于 2011-10-11 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的模板是人的基因组DNA,用chelex-100提取的.
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发表于 2011-10-11 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的模板DNA是什么的DNA？

===========================================

我的模板是人血提取的基因组DNA, 用chelex-100提取的.
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发表于 2011-10-11 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好,我很难过,这一周重购了酶和dNTP, 但结果连原来扩增的带都扩不出了.只有远大于300bp的地方出现一抹带痕,并无明显条带.我检测了酶和dNTP,发现俩者都没问题,我都要疯了.希望大家出出主意,谢谢  
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 小中大
1、模板DNA好象太多，模板DNA质量如何，检查过没有？
2、PCR第1步是否改为，95 ℃ 5分钟？
3、其实，最关键的是你PCR的退火温度，引物的Tm值是多少，建议用降落-PCR把退火温度摸好，因为它对特异性扩增是最重要的！
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发表于 2011-10-11 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题有一种可能性
你使用的taq酶里面有一些ecoli的genomic DNA的片断，然后你的引物正好match这一段，所以出现一条无法取出的非特异性条带
你可以使用那种过过柱子的taq酶，可能会好些
顺便问一下，你做这个pcr的目的是什么？也许可以帮你想想其它办法
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