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标题:[求助]限制性酶切

duoduo[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]限制性酶切

[求助]限制性酶切


求助：
我这几天进行VDR限制性酶切反应（TaqI、ApaI两种酶），反应体系为15微升。其中PCR产物4微克，两种酶都是10U，10＊Buffer为1.5，DDW补足，可是切了一个晚上却没有切下来（水浴温度正确，分别为65和37度）， 是什么原因阿？我见说明书一般都是50微升体系，是不是我应该用50微升体系（其它成分不变，仅用灭菌双蒸水DDW补足）？
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幽兰君[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
体系不是问题，若你15微升体系能看见带，切不出来就是切不出来。放大也没用。我的分析可能原因如下：
1，DNA不纯，可考虑纯化一次。
2，双酶切体系有没问题，请自觉查看一遍，这是做实验的基本原则。
祝好运！

正在申请中级，望大家多多支持！谢谢各位战友！！！
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欢迎大家参加细胞信号转导讨论区!加入我们的未来之星!!!
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.不知道所用的两种酶，有没有问题，有时污染或是存放时间过长，会导致酶活力丧失。
2.PCR反应导致酶切位点碱基变化。
3.PCR产物是否经过回收步骤，如果没有可考虑DNA精制一下。  
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嘉年华[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
体系应该没问题，可能酶活性下降。电泳后有条带吗？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的pcr 扩增出来的条带本身就很弱（我是用chelex100提取的DNA，上清已转移出来，冰箱4度保存有4个月了，25微升体系我加了6微升chelex提取的DNA，条带还是很弱）。酶切后（40微升体系加入8微升pcr产物，酶10U，10＊Buffer用了3微升，余用灭菌水补足）竟然条带更弱了，ApaI酶切就什么都没有，TaqI酶切的也很弱，几乎不敢确认，Markar带很好。
请问：1、我该怎样才能使我的PCR扩增产物条带变强啊？
2、酶切该如何优化阿？
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先你的DNA保存问题：一般放于－20度保存，为什么要放于4度呢，而且那么长时间。
产物量多量少不仅跟模板量有关，（你测模板OD值了吗，你应该知道你在体系中加了多少ug的DNA）还跟模板质量、循环数、退火温度、你目的基因的丰度等有关。
如果你的条带很特异，没有smea，即使条带很弱，那还是有办法提高产量的，那就是第二次PCR，将你第一次产物百倍或千倍稀释，取一微升作模板，其它条件与你第一次PCR一样，再括一次，应该会提高产量的。
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泉水叮咚[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DNA片段有多大？如果片段比较短的话经过电泳跑出来也是模糊的。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已经放到4度了，这是我的错误。我测过我的chelex提取的DNA浓度（20纳克／微升，检材为血痕纸片），我用酚－氯仿提取的DNA调试的扩增条件（结果用chelex提取的DNA就是扩不出来，我将Mg浓度调到1.1mM才扩增出来，但是很不稳定，条带很弱，25微升体系中加入6微升DNA还是那样。）我的一次PCR扩增产物浓度为500纳克／微升，我进行二次pcr却扩不出产物来（体系条件和一次扩增一样，只是25微升体系加入2微升一次扩增产物），这是什么原因阿？另外我的PCR扩增片段是501bp，酶切后的片段均是200多bp。我用的是生工的普通Taq酶。我做了一些对比试验，原因就是出在我的chelex提取的DNA问题上了，重新提取是不可能了，现在我想解决的问题是如何处理一下我的chelexDNA，能使它和酚氯仿提取的DNA一样扩增出带来？
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米米[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
除了上述问题外，我想问一下，你设计带有酶切位点的引物是否带了足够、合适的保护碱基，若无保护碱基，是难以切动的
不同酶切位点的保护碱基数目和类型不同，你可以登陆下面的网站查询一下
cuturl('www.neb-china.com')
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
介绍一种方法：

1.PCR做完后仅仅只有一条非常特异的条带吗？况且还有很弱的扩增条带电泳时看不出来，我建议你用胶回收特异条带。担心DNA量不够？不要紧，多扩几管同时进行，回收在一个柱上。

2.酶切反应前先要将PCR回收产物定量，这点非常重要。一般20ul体系10U酶切目的基因的量不应该超过1ug，超过了酶切比较困难。体系不宜放大，比如20ul体系的放至50甚至100酶切效果不是太好。所以建议就做20ul体系，跟PCR一样多做几管。有点笨，但是非常实用。

3.从你做试验的情况来看，好像每次不是特别稳定？这点非常重要，尽量保证每次实验的稳定性和重复性。

4.在确定以上几个问题都很好解决的前题下，如果还是切不开，考虑换其他公司的酶。从我们的经验来看，NEB、罗氏 、Promega都不错。当然，这只是个人意见。
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