[求助]求救RT_pcr，结果老是不稳定啊。看来需要调整

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标题:[求助]求救RT_pcr，结果老是不稳定啊。看来需要调整

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]求救RT_pcr，结果老是不稳定啊。看来需要调整

我得RT－pcr就是跑不出来。用的是tarkalar的一步法试剂盒试剂盒提供的阳性对照有的可以跑出来，说明试剂盒应该是好的。
以下是我采用试剂盒提取的细胞的总mRNA,
稀释40倍测定
260：0.518
280：0.252
ration:20.6
密度：20.7μg/ml
每一次用1μg样本。
引物：

1
sense primer 5′-TGTTCATGCCGACGCTTGCA-3′
antisense primer 5′-TTCCAACTACACAGTTTATT-3′

2
sense, 5’-CAACATCACCTATTGGATCC-3’;
antisense, 5’-CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3
反映条件：

逆转录：50度20分，以后是95度5分，94度30秒，60度30秒，72度1分，74度10分。
一什么也没有，二有一个白色的脱尾。
请高手帮忙
我改怎么办？
顺序是mark, 2,3是因物1的，45是引物2的。引物是参照文献的

[ 本帖最后由乌贼老弟于 2011-10-12 14:55 编辑 ]

附件

2011-10-12 14:55

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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RT做不出，第一个要考虑的问题就是基因的表达两够不够，否则都是白忙乎

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

基因的表达量？请教，意思我的提取的rna量太小？请教啊

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RNA量的大小是一种因素，还有一种可能你做的目标基因本来就表达两非常低下，事实上面很多基因就是这样。所以你目前的模板量，循环数批不出来。
建议你增加循环数量，然后如果可以批出来，在减小循环数，适当增加模板数量。
如果这样都不行，建议你看看引物有没有问题，如果没有建议你去做real time或者rt southern

鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pcr是一个很敏感的技术，如果引物设计的没有问题，你逆转录过程没有问题的话，一般都能p出来的。你的地一对引物建议重新设计一个反义引物试试，另一种方法也可以把你的退火温度降低尝试。如果你想验证你的反应体系有无问题，可以用GAPDH或其他内参p一下。对于你的第二个样品，出现了smear一片，好象是你的模板太杂或是量特别大，具体原因不好说。我觉得你可以把逆转和pcr分成两步试一下。出现结果可继续讨论。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

处理你的问题两个一般原则：
没有扩增
1) Check template quality. Check the integrity and purity of the template RNA by agarose gel
electrophoresis. Include an RNase inhibitor in the RT-PCR to prevent template degradation
2) Adjust RNA template concentration. Increase the amount of RNA template in the RT-PCR.(2ug/20ul system)
3) Lower annealing temperature. Lower the annealing temperature in 5C increments.
4) Alter the concentration of MasterAmp PCR Enhancer in the reaction. Add increasing
amounts of MasterAmp PCR Enhancer to a final concentration of 1X to 3X.
5) Increase number of cycles. Perform additional cycles in increments of 5.
6) Vary reaction components. Vary the amount of MMLV-RT Plus, MasterAmp TAQurate DNA Polymerase and primers.
出现smear现象：
1) Check template quantity and quality. Check the integrity and purity of the template RNA by agarose gel electrophoresis.
2) Decrease concentration of reaction components. Decrease the amount of enzyme, RNA template or primer added to the reaction.
3) Increase annealing temperature. Increase the annealing temperature in 2oC increments.
4) Alter the concentration of MasterAmp PCR Enhancer in the reaction. Add increasing amounts of MasterAmp PCR Enhancer to a final concentration of 1X to 3X.
5) Decrease concentration of reaction components. Decrease the amount of enzyme, RNA template or primer added to the reaction.
6) Redesign primers. Design primers that have higher annealing temperatures and do not form
hairpin loops or primer dimers.
7) Check primers for degradation. Check by electrophoresis in a denaturing acrylamide gel.

你的问题分析：
1 通过BLAST分析，知道你的第一个产物大小约SPG7 300bp，第二个 mmp9（Homo sapiens matrix metalloproteinase 9）约450bp，详见1090469306-15016-18314868682.BLASTQ4。
2 从图看，你的RT 反应是不成功的。这个原因比较的多。
3 再次得分析一些问题，可能得做相应的改进了。
A 引物污染了没，Buffer, dNTP呢？
B H2O污染，是PCR假阳性常见原因，因为许多人常常忽略对3dH2O的保管；
C 引物的浓度0.1pm/ul，适当的降低些
D Template量过多，dNTP量过少，镁离子浓度

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-12 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

由此可以进一步改进：

1 选特异的下游引物反转录
2 RT的温度调整为42 1小时；
3 95度2分（将时间减少）；60度30秒（该温度过高），dNTP量适当降低。
4 增加酶量，在PCR过程中补加加一点TAQ酶
5 镁离子浓度降低
6 建议你作TOUCH-DOWN PCR，可以增加特异性。

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2011-10-12 15:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

TOUCH-DOWN PCR
谢谢专家的帮助，这个应该很好。可是我就是买了这么一个奇怪的试剂盒，因为有人建议说很好作，可是呢？我什么都没有。痛苦，再向老板说走不好意思了。苦啊！！！！
引物污染,我不明白，我的是新的
水应该也没有问题
我觉得是不是
我的如rna量太低的缘故阿
困惑