生物质谱

液相色谱-质谱／质谱联用技术的进展及应用
作者：方晓明，张社 来源：检验检疫科学
摘要：简介了液相色谱-质谱，质谱联用技术的新进展，综述了近年来该技术的应用及其发展前景。引用文献24篇。
关键词：液相色谱质谱，质谱综述
   
1 前言
    近年来，由于液相色谱-质谱，质谱(LC-MS／MS)联用新技术的不断出现，LC-MS／MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。LC／MS的联用始于70年代，90年代以来，由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联用，特别是与串联质谱(MS/MS)的联用得到了极大的重视和发展。LC-MS／MS联用的优点非常显著，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS／MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物，显著提高信噪比。
    液-质联用是通过一个“接口”来实现的。在接口研制方面，前后发展了有20多种，其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透薄膜界面、热喷雾界面和粒子束界面，但这些技术都有不同方面的限制和缺陷，直到大气压电离技术成熟后，液-质联用才得以迅速发展，成为科研和日常分析的有力工具。

接口基本原理
    有关各种电离技术文献已有评述，目前主要采用大气压电离(API)技术，API包括电喷雾电离(跚)和大气压化学电离(APCI)。
   
2．1 电喷雾电离(ESI)
    溶液中样品流出毛细管喷口后，在雾化气(N2)和强电场(3～6kV)作用下，溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强，离子向液滴表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得+ 或-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测量的是质，荷比(m/z)，可测定的生物大分子的质量数高达几十万。
    ESI是很软的电离，可直接测定热不稳定的极性化合物，多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子，调节离子源(源内ID))电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

大气压化学电离(APCI)
    溶液中样品流出毛细管后仍由氮气流雾化到加热管中被挥发，在加热管端的Corona尖端放电电极(最初利用同位素Ni的电子放射)使溶剂分子形成反应气等离子体。样品分子与等离子体通过氢质子交换被电离，形成+或-，并进入质谱仪。
    APCI也是很软的电离，只产生单电荷峰，适合测定弱极性的小分子化合物。另外，它适应高流量的梯度洗脱，高低水溶液变换的流动相。通过调节离子源电压，可以得到不同断裂的质谱图。

接口是液-质联用的关键部分，在这里完成溶液的气化和样品分子的电离。由于大量生物样品的背景基底非常复杂，即使经过 分离，还会很“脏”。因此在接口设计时，既要考虑离子化的效率，亦要考虑接口的抗污染和耐用。图给出了几种不同的API“接口”形式，采用Z字形通道离子束引进系统，避免了中性或非挥发性物质直接进入采样孔，可有效地防止接口的玷污。

LC-MS／MS联用是继GC／MS联用之后又一新兴的分离检测技术，近来发展极为迅速。它在生命科学、环境科学、法医学、商检等领域得到了广泛应用。

药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质量的一个重要方面。使用LC-MS／MS可以简便地对药物中杂质加以监控。Nicolas对抗癌药物DuP941生产中有关杂质建立了LC-MS／MS指纹图谱，不同生产的批次药物与已建立的谱图对照，从而达到质量控制目的。Zhao鉴别和测定了氯沙坦片剂在储存过程中产生的微量降解产物。Rourick建立了鉴定药品杂质及降解产物的LC-MS／MS方法，如头孢羟氨苄通过酸碱或加热处理使其降解，然后反相C18柱分离，利用MS／MS功能来鉴定杂质及降解产物的化学结构。
    体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分析化学家的挑战。
    LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复杂样品仍可达到很高的灵敏度。LC-MS／MS对生物样品的提取、纯化和浓缩等前处理过程没有严格要求，一般采用液液萃取法(LLE)或固相萃取法(SPE)，但这两种方法的缺点是比较费时。在线萃取技术在省时和省力方面显出相当大的优越性。现有几种在线萃取技术，如在线固相萃取、柱切换、涂层毛细管微萃取(CCME，有时又称固相微萃取(SPME)、多元LC系统等。在线萃取技术使得LC-MS／MS优点更加明显，它可以实现微量、高通量样品分析。

生物大分子分析
    LC-MS／MS可实现蛋白质的快速高灵敏度鉴别和测定，蛋白质酶解后，产生多个肽段，经过LC分离，用MS／MS可获得肽的质量谱，因此可对肽段进行鉴别和测定；通过蛋白质序列数据检索，可得出蛋白质序列信息。利用LC-MS／MS还可以开展DNA-药物结合态分析，肽及蛋白质与金属离子配位研究等。

与已成熟的GC—MS联用技术相比较，LC-MS／MS联用技术还处于初期发展阶段，它的应用才刚刚起步。但LC-MS／MS所具备的一系列优点，决定了它的应用前景比GC-MS更为广泛。在“接口”方面，API接口的成功应用，使得液-质联用成为可能。在对大分子和小分子化合物分析中，展现了它作为通用接口的广阔应用前景。采用API Nanospray接口。适合于分析超微量的样品，如生化样品或法医样品，灵敏度可高达fmol，能够实现微径HPLC与质谱的联用，这是近来的一个发展趋势。
    在串联质谱方面，目前以四极杆串联质谱为主，它可进行MS1和MS2操作(空间上)。离子阱质谱和富利叶变换质谱(FT—ICR—MS)亦可完成多级串联质谱分析(时间上)，离子阱质谱通过改变阱里射频场最多可进行10级MS操作，FT-ICR-MS通过离子回旋共振进行多级MS操作。飞行时间质谱(TOF)作为第二个质量分析器，由于其分辨率高、质量范围宽、扫描快和灵敏度高等优点，成为一个重要的发展方向。
    LC-MS／MS联用技术愈来愈多地受到人们的重视，一些国际著名的分析仪器公司和研究机构建立多个研究实验室参于研究开发。总之，为应用目的而建立的LC-MS／MS联用技术会越来越多，应用研究课题也会越来越多。

1 NIESSENW MA．．J Chromatogr A，1998，794：407～435
2 NICOLAS E C，SCHOIZ T H．．J Pharm Biomed Anal，1998，16(5)：825～836