【求助】寝食难安的几个Real－timePCR问题

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标题:【求助】寝食难安的几个Real－timePCR问题

西子[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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盲
1、我用双deltaCT法相对定量，必须通过两条标准曲线看他们的扩增效率是否一致，而我想将内参和目的一起扩增（同管）来避免系统批次差异，但是不管是同管还是分管，只要是在一台机子上一次反应进行（ABI7500），就无法同时做两条标准曲线,怎样化解这对矛盾？
2、做标准曲线的每一个稀释梯度要做重复吗？如果做了重复，怎样设置程序使机器（ABI7500）将重复的CT值平均后再描点做曲线呢？即如果做了重复，机器是用15个点描线还是用5个点描线（假设5梯度，每梯度3重复）？可否不用机器自己做的标准曲线，而自己将5组数据输出用其他的软件做呢？
3、ABI7500做标准曲线时，每次都是要先指定5个梯度，等反应结束后才给出标准曲线然而，通常在我们没有看见扩增曲线结果时，无法判断哪5个梯度合适，所以在指定这5个点的时候，我总是心惊胆战，难道就不能先看了扩增结果，觉得哪几个梯度好，再指定它做便准曲线吗？搞科学不能老是当瞎猫啊！

jude[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看来你还没有把SDS软件研究透。
1、用TaqMan探针的话可以放在一起，用Sybr的话只能分开了，可以先将一个设为Standard，另外一个设为Unknow，做完PCR后，分析一个基因后，再通过SDS软件，将Standard和Unknow互换，分析另外一个基因。
2、个人认为肯定需要做重复的，至少3个，重复的标本起同样的名字，软件就会自动求平均值做曲线，应该是安照每个梯度的平均值做曲线，但是标准曲线图上会出现15个点。也可以将这15个Ct值导出，自己做曲线。
3、ABI7500做标准曲线不一定要5个梯度，可以6个，7个都可以，只要在分析范围之内就可以，也可以先做上10个梯度，做完后，再根据扩增曲线，通过SDS软件将不需要或不好的点去掉，保留比较理想的梯度范围。
搞科学首先要把用的东东研究透才能更好的发挥它的价值。

西子[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我将继续努力弄透SDS软件！！另外还有一个问题向大侠们请教：
我用PRIMER EXPRESS设计了一对引物和探针，引物通过普通PCR（25ul体系）、测序验证完全正确，但是加上探针就扩增不出来了（50ul体系），不晓得是什么原因？上下游引物，探针长度：25---22---26bp，GC含量：百分之48---54.4---57.7，TM值：59--58.3--69.6
普通PCR体系25ul：目的片段96bp
10xpcr buffer－－－2.5
dntp－－－1ul
taq－－－1ul
F－－－1.25ul（10uM）
R－－－1.25ul（10uM）
cDNA模板－－－4ul
水－－－14ul
反应条件：94－－－3min
94－－－50sec
60－－－30sec
72－－－15sec
72－－－10min
30cycles
换成一步法Q-PCR后就扩不出来，难道我需要再在50ul体系下摸索好了条件再把探针加上去吗？因为我做的50ul体系是以前师姐摸索好的，我只是为了提高该方法的灵敏性和特异性才自己设计的引物和探针，目的片段长度及引物探针的TM值都与以前师姐设计的相近，所以认为沿用她的体系我觉得应该不会有问题的，请大侠们指教

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发表于 2016-2-6 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果用PRIMER EXPRESS 3.0默认参数设计的引物，Tm值基本都在60度左右，不会差太大，并且如果是普通TagMan探针的话，探针引物Tm值应该比引物的Tm值要高一点点，这样在退火时探针优先与模板结合，你的引物似乎不太符合这个原则。TagMan-MGB探针没有分析过，单纯探针序列要短，Tm值也要低，加上MGB就不知道了。
我曾经分析了一下PRIMER EXPRESS 3.0设计的引物，有时有很严重的发卡结构，但是评分还很低（这个软件分越低越好），我觉得还是关键在于要配合ABI的试剂合，ABI的Gold Taq是数一数二的，基本上用PRIMER EXPRESS 3.0设计的引物，加上ABI的试剂合，加上ABI7500默认反应条件，基因只要有表达，都能扩增出来，ABI似乎努力将其做到傻瓜化。
曾经也摸索过扩增效率，结果几个基因都在100％以上，并且相差不大，后来就没有再做，将PCR产物设计在150bp以下，用ddCt方法来做，结果还是不错的。
关键还是Taq，Taq影响其扩增效率，不同公司产的Taq及其buffer的确不太一样，一分钱一分货。

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发表于 2016-2-6 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是2.0的，我的探针比上下游引物高出10度，难道你的意思是太高了？不会吧？普通Taqman就是要这样的设计啊！我用的退火和延伸一个温度：60度，而探针的TM值是69.6肯定能退火，并且先于引物结合上去啊，引物我验证了是没有多大的问题，探针自身也没有多大问题，问题可能存在于引物于探针之间？我用PP5检查了一下，虽然有发夹，dimer，cross dimer等，但是引发的效率抖很低的。deltaG的绝对值很少有超过10的，我用的虽然是普通的Taq酶，但是师姐的同样体系，同样条件也扩增得很好啊？

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发表于 2016-2-6 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，不好意思，看错了，上面的Tm值，以为中间是探针的。
不知实验时有没有做对照，阳性对照，阴性对照，这样出了问题才好分析，实在不行就让你师姐做一下，看看她做的如果。
PCR这东西说简单也简单，说复杂，也够复杂的，我相信很难有人说自己是PCR专家。

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发表于 2016-2-6 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我来提几点建议：
1：确认用你师姐的引物探针做过对比实验，这样可以确定反应体系没有问题。
2：保证CDNA的质量，可以构建一个质粒，用质粒考核体系。
3：你的退火温度用的是60度，从你引物TM值来看，两步法时60度应该高了些，你可以试着降退火温度，比如做58度和55度。
4：如果降退火温度还是出不来，那么做完Real－timePCR后跑凝胶电泳。用你师姐相同CT值的产物做对比，用凝胶软件分析产物情况，如果产物对比没有问题，那么问题出在探针上，你探针GC含量为57.5%，应该没有问题。你核对一下设计序列无误后就可以和合成公司的技术人员交流了，这种情况大部分是探针的合成质量不好。
供参考，祝实验顺利！

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发表于 2016-2-6 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

答1：以做，确定体系没有问题（只是可能要优化）
答2：我做的是RNA，一步法，只能用RNA做模板，采用的是大量提取后稀释混匀的策略。
答3：60度没有问题，不管是25ul还是50ul，普通PCR我都用的60度，扩出目的条带。
答4：我们做完Real－timePCR后不让开盖跑凝胶电泳，避免气溶胶。
最后我采用很傻的普通一步法RT-PCR的条件跑出曲线，不过很丑
反应条件：
42度－－－20min
94度－－－3min
94度－－－50sec
60度－－－30sec
72度－－－30sec
40cycle
60度收集荧光
曲线如下，请大侠们给点意见，跪谢！

西子[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Realtime－PCR扩增曲线

附件

2016-2-6 10:12

70841709.snap.jpg (38.06 KB)

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发表于 2016-2-6 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，看了这张图，我怎么感觉仪器有问题
首先：从图上可以看出扩增效率不高，没有明显的指数期，从我做过的优化实验来看，降低退火温度应该会有帮助，电泳pcr和实时pcr并不等同，电泳pcr在60度退火可以得到很好的产物，但是在实时pcr时，你引物的退火温度仅为58.3，很有可能导致引物和模板结合不稳定，也就导致没有明显的指数期。（不知道在你的实验室中，针对你的rna有没有其它跑的很好的引物探针，有的话，用他们的引物探针检测模板数，会更有利于结果分析）
其次：试着优化反应体系，我这里提供一组基础试剂，你可以试一下，试剂均为终浓度
Tris-cl（PH9.0)--20mM
Kcl----------------50mM
Mg---------------1.75mM
EGTA------------0.25mM
TMA-------------1.5mM
Taq--------------2u
dNTPs------------0.2mM
引物浓度:各500nM
还有：你可以做下探针梯度

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