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标题:【求助】总RNA提取不出来

乌贼老弟[使用道具]
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【求助】总RNA提取不出来

各位大虾!
本人准备做椎间盘的髓核的水通道蛋白的相关研究,但是组织的总RNA老是提不出来!要不就是总的NG数达不到要求,要不就是OD值达不到!跑的胶是一片空白什么东西也没有!我用了TRIZOL也达不到要求!
请帮忙分析一下原因!!!!谢谢
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baidukk[使用道具]
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个人认为提取RNA要注意几点:1)快速 尽管不要求你象百米赛跑一样快,但是也不能慢条斯理的,我们实验室的提取RNA的时候凡是离心的时候都是小跑进行的(因为离心机和操作台不在一个实验室),从取组织加液氮研磨开始到电泳检测条带都要快,最主要的目的当然还是尽量防止RNA的降解了。2)组织充分研磨 要使组织尽量研磨碎,匀浆化,这样更有利于细胞的裂解。为了尽量缩短时间,可以先用锤子先将组织锤碎,然后赶快加液氮,研磨,然后尽快加裂解液。匀浆化后室温静置的时间要足够,这样核蛋白复合物才能完全解离。3)操作要严格 尽量戴好口罩、帽子,每次操作的时候都尽量戴上手套,下一步操作的时候换一个手套,这样最大程度地避免RNA酶的污染。4)尽量离心都在低温离心机操作,但是如果你的操作够快,个人觉得也可以在常温离心机中操作,有段时间我们实验室低温离心机坏了就经常在常温离心机中提取RNA,一样能提取的很好,还有就是操作的时候也没必要在超净台中操作,就在一般的台子上就可以了,最好在离心机旁边,这样能最大程度的节约时间。5)时间要安排合理 比如在离心的时候就要准备好下一步用的东西,在提RNA之前就要倒好胶,在最后一步离心时就要准备好电泳的loading buffer,电泳时间最好15分钟内,电压高一点170v,总之是最大程度的避免RNA的降解了,祝你成功!
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bring[使用道具]
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我的两点建议:首先,除试剂盒有特别说明的步骤外,整个过程应该尽量保证在冰上进行。其次,组织研磨过程我以为很重要,一定要快,而且要尽量避免此过程中标本温度升高。所以,选择一种最合适的研磨工具和步骤是很必要的。
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乌贼老弟[使用道具]
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谢谢!
操作应该没问题的啊!我请人家做过!还是没结果!用人家的TRIZOL还是没什么结果!真的很郁闷!!
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乌贼老弟[使用道具]
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5
 
请问用液氮研磨有什么特别要求吗?
我以前用的是匀浆器,可是组织不能完全研磨碎!
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乌贼老弟[使用道具]
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是不是用液氮研磨后还得用匀浆器匀浆?我用液氮研磨后已经是粉态的了!
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viviwang1987[使用道具]
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7
 

我们的程序是加了trizol低温浸泡一段时间,然后用匀浆机在冰上匀浆。还有最后用洗RNA的时候一定要小心,很可能RNA丢失
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cbou876[使用道具]
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8
 

用液氮研磨后就可以了,目的是使组织块变小,便于后一步加trizol使核蛋白体完全分解。加入trizol后,要确保trizol中的组织不能成团,有结团的话要吹打均匀。另外,加异丙醇反应这一步,要混匀使rna与异丙醇充分反应,使其沉淀。我之前有过深刻的教训,因为没混匀,白白浪费了一个多月,最后才找到是这个原因。还有可能就是rna出来后,加入75%乙醇这一步,要注意先加750ul乙醇,后加250ulDEPC水。
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乌贼老弟[使用道具]
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谢谢各位!
我已经严格按说明书操作了,怎么还是提不出来啊!各位大侠有人用过PROMEGA的GV-total RNA isolution这个试剂盒吗?OD值为什么会出现负数啊?
等待各位的解答!!!
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standbyme[使用道具]
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我说几点建议:
1.液氮研磨时,要随时加入液氮,我们磨一个样本要加3-4次液氮,并且要快速研磨。最好能有个人帮助加液氮!
2.OD值出现负值……有可能是调零时没洗好吧!
3.怀疑一下,你的样品保存中没出现什么问题吧?比如说融化了什么的,那样RNA就降解了,虽然这种错误很少有人犯,但是,不排除可能性啊!
4.实验前的灭酶处理很重要,我们当时进行了好几天,剪刀镊子,研钵,饭盒,水,枪头,离心管……都用DEPC水泡了,然后高压,烘干,当时感觉可繁琐了,事实证明,前期工作做好了,后面会很省力的。
我也是第一次做,一步步很谨慎的走,希望你能成功!
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