[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

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标题:[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

开个帖子,有定量PCR相关的问题可以提问,如果有类似/雷同的问题我会整理在一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。

现在将每一页的主要问题整理一下

不建议用普通PCR来验证定量引物以及摸索定量的反应条件。

Page1：
1.做目的基因表达量分析的简易小流程。
2.什么样的实验数据才是可靠的呢？

Page2：
1.多重PCR与单一PCR仅仅是引物探针设计上的差别吗？
2.选择绝对定量还是相对定量？
3.如何判断体系的阴性对照是否有污染？
4.溶解温度曲线是如何制作的？

Page3：
1. 定量引物与普通引物的设计差异。
2.如何稀释标准品。

Page4：
1.相关系数与斜率的意义。
2.- △△CT法与标准曲线法的比较。

Page6：
1.反转录前应将totalRNA调整的统一且适当的浓度。
2.模板、preMix均不建议用振荡器混匀。

Page7：
1.total RNA无法电泳以及测OD
2.溶解温度曲线有两个峰怎么办？

Page8：
1.一步法试剂盒与两步法选择上有什么差别？
2.cDNA不能测OD。

Page9：
1.△△CT法要求的扩增效率
2.阈值的民间调整法
3.溶解温度曲线的制作过程

Page10：
PCR反应时模板添加量

Page11：
商品化的premix，只选适合自己的。

潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简单说一下做定量PCR的流程(以RNA起始为例):
1.提取total RNA
针对不同的组织选择不同的试剂盒提取total RNA,尽量严格按照试剂说明书的要求来进行.
提取过后,需要对totalRNA进行质量测定,包括两个部分,一个是1%琼脂糖胶电泳,确定是否降解,一般来说动物组织来源的质量好的total RNA电泳有三条带,28s为最亮,理想情况下接近18s亮度的2倍,5.8s最弱,只是很模糊的一条带;某些植物组织有4条带。并且，如果在电泳前能将total RNA变性一下，跑出来的图片会更漂亮，28S上面是比较干净的。另一方面是测OD

DDD[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好！我做的是探针法的绝对定量。对于试验后数据分析有一些疑问。看过一些文献，大都要分析ct值变异系数（包括批内和批间的）。变异系数是CT值标准偏差/CT值平均值，但是这样计算只能计算一个点或多个点的变异系数。我见别人文章中有直接评价一个试验或某次试验的变异系数，这是怎么计算的？
另，除此之外绝对定量还有什么一定要分析的方面？
望解答。

潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，我不确定您做绝对定量的目的是什么，但凡围绕着实验目的的结论都是有必要分析的。呵呵，看起来是说了一句废话，不好意思啊。

您用的定量仪器是什么呢？现在的软件功能都很强大的，类似于最终定量结果的标准偏差数量都会直接给出，不需要人工来算的。是否有评价整个实验的变异系数这样的说法，我还需要再研究一下，不能给您个确切的答案，抱歉。也希望您找到答案后能跟告诉我，谢谢！

广泛的说一下实验数据可靠性的分析：

1。要看一下有没有偏差特别大的数据，换句话说，本该是阴性的，结果有比较弱的扩增即Ct值较大的扩增，如果有的话，可以手工确定基线、阈值，如果实验的背景太高，还可以消除背景，这样做，会比机器自动给出的扩增曲线和标准偏差等一些图片和数值要好一看些，但如果对于手动调整完全没有概念的的话，还是建议自动生成。对于有些样本忘记加模板或者其他操作失误，请无比忽略该反应孔的数值统计，否则，结果很难看，甚至有可能对趋势产生影响。

2。实验整体控制情况，包括标准曲线线性范围、扩增效率、相关系数、引物特异性、多重探针的的话要看各检出通道之间是否有干扰；如果是SYBR方法的话，还看融解温度曲线的峰是否单一并且且温度是否一致、正确。

3。样品的重复性是否好。

魔法师A[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我做的是MGB探针的定量RT-PCR，最近一直做不出来，我的引物没有问题，我想问问，做荧光定量PRT-PCR的酶和一般的RT-PCR的酶是不是不一样啊？

mooon[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好！
我做的是普通Taqman探针的相对定量荧光定量PCR, 目的基因：IL-4,内参：beta-actin；仪器用的是ABI公司的7500 Real Time PCR System，经SDS软件自动分析得到下图：
左边是b-actin，由于IL-4的相对定量按照内参的相对定量进行了标准化，所以b-acting的表达水平是0。
右边是经不同处理后的标本，依次记为C1,C2,C3,C4.我将C1作为对照校正，表达水平设为1，取对数后为0，C2,C3,C4皆与C1进行比较，得到图中数字。
图片不是很清晰：（C1=0,C2=-0.802(绿色）,C3=0.056（蓝色）,C4=-0.486红色)

我要请教的问题是：
1.图中数字的含义是什么？是直接说明表达量C3>C1>C4>C2吗？还是表示倍数关系，负号表示降低？
2. 相对定量采用2-△△Ct法，那么图中数字与2-△△Ct是怎么一种关系？

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2011-10-13 12:11

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潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我做的是MGB探针的定量RT-PCR，最近一直做不出来，我的引物没有问题，我想问问，做荧光定量PRT-PCR的酶和一般的RT-PCR的酶是不是不一样啊？

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各个公司的试剂是不一样的,不能简单的说普通的和定量的酶是不是一样,但一般情况下,都是有区别的,同一种酶,来源不同,差异也很大.因此,不建议你为了节约那么一点点成本而混着用.事实上,你在实验的每个小细节都注意到了,保证实验一次成功会节约更大的成本.另外,普通与定量的缓冲体系也是不同的.

#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

能不能帮忙推荐一个公司的荧光定量的试剂盒

#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是刚刚接触这方面的东西，我还想问问，你所指的普通与定量的缓冲体系也是不同的. 能说的具体点吗？谢谢！

pou[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用荧光定量PCR做snp,用DNA做，结果一直不理想，有一个位点的扩增效率太低，一个溶解曲线为双峰。我怀疑我的引物不是很好，能否给一些建议。十分感谢

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