小中大【分享帖】Q-PCR的原理及△△CT算法的分解
我由于最近在做Q-PCR，以下是我的一些心得，希望对也在做Q-PCR的战友能有一些启发，相互探讨，如有不妥之处，敬请指出！QPCR基本概念
Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
SYBR是非特异性地结合到双链DNA中的小沟部位从而发出荧光的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。
△△Ct法的推导过程
PCR指数扩增公式是：
Xn = X0 * ( 1 + Ex )n [1]
式中，Xn是第 n 个循环后目标分子数，Xo 是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n 是循环数。用Ct 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此：
Xt = X0 * ( 1 + Ex )Ctx [2]
式中，Xt是目标分子X达到设定的阈值时的分子数，是一个常数。虽然每台机子设定阈值的荧光信号是一样的，但是由于每份子不同双链DNA能结合的SYBR的量是不同的，所以不同目的基因的Xt是不同的，但是对某个特定的基因Xt是特定的的常数。Ctx是目标分子X扩增达到阈值时（即达到规定的拷贝数时）的循环数。
对于看家基因的PCR反应，也有同样的公式：
Rt = R0 * ( 1 + ER)CtR [3]
式中，ER是看家基因R扩增效率。Rt是看家基因R达到设定的阈值时的分子数
假设目标序列与看家基因扩增效率相同，EX= ER= E，用目标分子数（常数）除以看家基因分子数（常数），即目标分子与看家基因的表达量比值K，K是一个常数。
K = Xt / Rt = [X0 * ( 1 + E )Ctx ]/ [R0 * ( 1 + E)CtR ] = （ X0 / R0 ）* ( 1 +E ) Ctx- CtR [4]
将Ctx-CtR 称为 △Ct ，（ X0/ R0 ）称为 XN（初始目标序列与看家基因的分子数比值，其意义是经过通过内参校正之后的初始目标分子数），整理上式得：
XN = K * ( 1 + E) -△Ct [5]
最后用任一样本q的XN除以参照因子（calibrator，cb）（参照因子可以是正常对照也可以是相对对照）的XN得到：
XN,q/ XN, cb = [ K * ( 1 + E ) -△Ctq] /[ K * ( 1 + E ) -△Ct,cb ]= ( 1 + E ) –(△Ctq - △Ct,cb) [6]
于是将△Ctq - △Ct,cb称为 △△Ct ，这种数据分析方法称为△△Ct法。
对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率E接近于1 。因此目标序列的数目通过内参校正之后相对于参照因子而言就是
初始目标基因数/初始参比因子数XN,q/XN,cb = 2 - △△Ct
整理式 [5] 得，XN/ K = 2 - △Ct
常数K = Xt/ Rt， 在K≠1时，即达到阈值时，目标基因数≠看家基因数，其意义是消除实验处理造成的目标基因数≠看家基因数的因素后，初始目标基因数/初始看家基因数；当 K =1时， XN= 2 - △Ct 。
我之前一直认为算到△Ct就够了，因为知道目的基因相对内参表达的量XN，但是不要忘了我们还不知道K值.举个例子：假设扩增效率E=1，对照组内参基因（理论下每个细胞表达是一样的）CT值20，目的基因CT值18；实验组内参基因CT值20，目的基因CT值17，那么X对照组 = K * ( 1 + 1) -△Ct=4K; X实验组 = K * ( 1 + E) -△Ct=8K，因为我们无法计算K值，所以不管是对照组还是实验组目的基因与内参基因的比值都无法得知，但是我们可以计算说实验组目的基因表达是对照组的8K/4K=2倍， 得出处理过的实验组目的基因比没有处理过的对照组目的基因表达增加了1倍，其实我们也只是要这个目的。但是到底是要除以对照组还是随便哪一组的，之前群里一直有人讨论，但是根据我们推算，除以任何组都可以，（8K/XK）/（4K/XK）=2，但是如果是除以对照组的话，那么对照组就会变成1，实验组直接是1的倍数，这样作图就更方便，所以很多人会除以对照组。这就是为什么要算△△Ct。
