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标题:【求助】请教两个有关RT-PCR的问题（循环次数...

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发表于 2016-2-9 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教两个有关RT-PCR的问题（循环次数...

1.我需要做RT-PCR,目的是半定量的差异比较，听说做半定量的比较循环扩增
在平台期前结束，请教如何确定RT-PCR的循环次数？多少个循环合适？
2. 还有一个傻问题我这的凝胶成像系统只能成像，但不能测定灰度值，
如我电泳后将先在我这成像，成像的图片再哪到别处测定灰度值，
是否可以 ？结果是否同直接在别处成像是一样的？
请各位高手指教，万分感谢！
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45778[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 一定的PCR体系，设置不同的cycle，PCR产物电泳，可观察到band信号强度呈梯度，选择中间强度的cycle 作为最后的cycle.
2 可以，只要有分析软件就可以。
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dog002[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

凝胶成像系统的软件中可以分析得到.
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eric930[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.做循环次数和扩增产物量的曲线,即在不同的循环次数下(如从20个循环开始,然后依次递增2个,直到35个或40个,一般不会超过的,当然也可以适当增加一下间距,而且可以视基因,如管家基因则很早就达到平台期了,目的基因则不同,和其表达峰度有关)结束PCR,然后将各个循环得到的PCR产物电泳,拍照,测定条带的辉度,将循环次数作为横坐标(X轴),PCR产物量作为纵坐标(Y轴),作出曲线,可以用EXCEL作图,得到S形的曲线,就可以确定指数扩增期了
2.目前使用的凝胶成象系统都可以进行RT-PCR产物的定量,如BIO RAD公司的QUANTITY ONE,如果你的不能,那就将图片保存,然后找一个凝胶定量软件进行分析,这应该不难,可以问一下相关实验室,总会找到能定量的地方的.软件一般会根据你的照片背景自动扣除背景值,所以在哪里成象都无所谓,不会影响结果,只是麻烦而已.
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qqshepherd[使用道具]
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 小中大

楼上的大侠：是不是还要根据不同的模板DNA量做不同的曲线？作图的时候用折线图就可以了吗？谢谢！
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wood533[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到这样的问题,不过我是用定量的方法比较差异,采用的定量方法是免疫学的模型,前提步骤也要进行PCR.我在在找合适的CYCLE使其在不到平台期的时候比较才有意义,这和起始浓度和循环数很有关系,最好是在指数中期的样子,而我这个方法限定了引物浓度必须<0.2,所以我要怎么样找到一个较好的起始模板和循环数?我很苦恼!!!!因为我的结果老是稳定差异.
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发表于 2016-2-9 22:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再请教一个问题，我在30个循环时进行PCR扩增，看到产物条带随模板量增加而增加，能说明30个循环在它的平台期前吗？
多谢！
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发表于 2016-2-9 22:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于你说条带随模板数量增加而增加,那是当然的,你如果模板量增加一倍,即使在平台期,根据用一个PCR体系的效率讲,产物也应该增加1倍,因为你的起始值就查一倍,所以应该固定一个浓度测定不同循环的产物量,这样比较才有意义.起始摸板的数量可以决定你这个PCR反应体系的扩增效率,有的基因表达比较低,你可能需要适当的cDNA量才能获得比较清晰的条带,你可以设置一个浓度梯度来选择最合适的起始模板量.
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yayya[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如何确定模板的起始浓度和循环数之间的关系,因为我做的实验必须要在指数增长期进行比较,而我苦恼于如何确定起始浓度和适宜的循环数来显示我两个基因数量上的差异,请各位大侠帮忙!!谢谢!!
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vcve[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

必须要做不同的循环数，找出适宜的循环数，这在于预实验中是必须做的
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