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标题:【求助】PNPG法测a-葡萄糖苷酶活性实验

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发表于 2016-2-10 20:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PNPG法测a-葡萄糖苷酶活性实验

最近在用酶标仪做a-葡萄糖苷酶抑制剂的研究，选用的方法是PNPG法。实验方法和原理本来应该很简单，但是将酶和底物先后加入96孔板反应30min后，最后加入0.2M Na2CO3 ，溶液没有显示明显的黄色，而且酶标仪测的OD值很小（不超过0.2），我用的酶浓度最大的有20U/ml，底物也是20mmol/L。这是为什么呢？另外，还有一个问题想要请教一下。我买的酶标签上写着250IU，2.9mg，111U/mg，含79%蛋白这几个主要参数，是不是有用的信息只有那个250IU呢？也就是说，我要是直接往该瓶冻干粉中加入2ml酶浓度就变成125U/ml了呢？多谢各位啦！！！
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发表于 2016-2-10 20:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也做这个酶，是做固定化。我觉得应该是这个酶活性在自然环境中损失很快，直观反映就是需要时间延长。我做固载的时候也是这样，甚至放置3d后才有黄色。对于这种酶活易损失的酶，楼主一开始分装的时候就应该直接往瓶子里加缓冲液，倒至离心管（或其他容器）里，稀释至所需浓度（一般按U表示），-20℃冷冻。要用的时候可以放到烘箱里（50℃左右）冻融，一有全部融化赶紧用，这样才能保证酶活损失最小。其他的酶活损失就不是人为所能及的了。至于瓶子上所标示的我个人觉得也只有250U能用吧~
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发表于 2016-2-10 20:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，底物水解产生的产物NPG只有在碱性条件下才能显色，最后加碳酸钠一是停止反应，二是将体系调为碱性。楼主所加的0.2M貌似不给力啊，试试1M的，我是这么做的。
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发表于 2016-2-10 20:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨晚上放在37度恒温箱放了一夜，结果变成淡黄色的了，OD值也升高了，但是最高的也就0.3左右。这是为什么呢？难道是酶活不行？恳请各位有谁知道这是神马情况啊？快被折磨疯了！金币可以给更多的哈！
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发表于 2016-2-10 20:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 seagate 于 2016-2-10 20:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也做这个酶，是做固定化。我觉得应该是这个酶活性在自然环境中损失很快，直观反映就是需要时间延长。我做固载的时候也是这样，甚至放置3d后才有黄色。对于这种酶活易损失的酶，楼主一开始分装的时候就应该直接往瓶子里加缓 ...

太感谢啦！感动啊终于有肯定的答复了。确实是呢，有的要放2-3天才有黄色。看来我还要再买一批酶，然后按照你的方法分装一下。请问除了这种方法外，还有没有别的比较好的可以体外抑制a-葡萄糖苷酶的模型呢？我还要做那个蔗糖和酶反应后，用血糖试剂盒测OD值的方法，但是貌似也得用到这个葡萄糖苷酶，晕啊！
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发表于 2016-2-10 20:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 seagate 于 2016-2-10 20:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还有，底物水解产生的产物NPG只有在碱性条件下才能显色，最后加碳酸钠一是停止反应，二是将体系调为碱性。楼主所加的0.2M貌似不给力啊，试试1M的，我是这么做的。 ...

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。
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发表于 2016-2-10 20:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 66+77 于 2016-2-10 20:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

太感谢啦！感动啊终于有肯定的答复了。确实是呢，有的要放2-3天才有黄色。看来我还要再买一批酶，然后按照你的方法分装一下。请问除了这种方法外，还有没有别的比较好的可以体外抑制a-葡萄糖苷酶的模型呢？我还要做那个蔗糖和 ...

还有一种测糖苷酶的方法就是和葡萄糖氧化酶联用，记得Talanta上发了一篇，具体没印象了，肯定是看过，你查查吧。但貌似不如这个方法来的容易，并且两种酶的话引入的影响因素更多，不好控制。现在做α酶的少，β的多就是因为这个原因吧。
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发表于 2016-2-10 20:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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原帖由 seagate 于 2016-2-10 20:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有一种测糖苷酶的方法就是和葡萄糖氧化酶联用，记得Talanta上发了一篇，具体没印象了，肯定是看过，你查查吧。但貌似不如这个方法来的容易，并且两种酶的话引入的影响因素更多，不好控制。现在做α酶的少，β的多就是因为这个原 ...

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。
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嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。...
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 小中大
后面要做的第一个实验就是动力学参数测定，有次可以得出酶底比，楼主加油吧，这个酶的确不好做。
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