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标题:【求助】农杆菌AGL1转化遇到问题

米西11米西[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】农杆菌AGL1转化遇到问题

做农杆菌AGL1（买的感受态），做转化，
加质粒，冰浴，液氮速冻5min，在37摄氏度水浴 5min，再冰浴5min，
加无抗生素的 LB 200 r/min孵育2-4h，
最后离心，留100微升悬液涂布于50微克每毫升的含利福平的LB平板。
28摄氏度培养，
说明书是培养2-3d，可是培养24h，就已经长出一片了，无单菌落啊，
这是怎么回事啊？是因为菌体浓度太高吗？
后来再做一次，操作与上述一样，最后过夜培养12h，AGL1在LB平板（含利福平）还是长成一片。
求经验的人指导啊
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zbboom[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
载体什么抗性，只加利福平肯定长成一片
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jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.加抗性，同楼上；
2.看看染菌没。另外，问下，感受态的农杆菌AGL1哪儿买的？
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发表于 2016-2-16 22:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jiushikeshui371 于 2016-2-16 22:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.加抗性，同楼上；
2.看看染菌没。另外，问下，感受态的农杆菌AGL1哪儿买的？

博迈德
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米西11米西[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 zbboom 于 2016-2-16 22:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
载体什么抗性，只加利福平肯定长成一片

只有载体的部分信息，有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的，在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo？？
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因，那么假如将该载体导入真菌后筛选时，可用G418吗？
含有Neo抗性基因就能抗G418吗？
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发表于 2016-2-16 22:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 米西11米西 于 2016-2-16 22:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

只有载体的部分信息，有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的，在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo？？
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因，那么假如将该载体导入真菌后筛选时，可用G418吗？
含有Neo抗性基因就 ...

你用的不是大肠杆菌的抗性吧
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米西11米西[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ALALA 于 2016-2-16 22:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你用的不是大肠杆菌的抗性吧

这个载体是别人给的，载体信息不全，以你的经验看是这个载体是Amp
和Neo这2个抗性标记？
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发表于 2016-2-16 22:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这个也是长了一大片，没法挑单菌落，我刚画的单菌落，但是长出来还是一片，老师说那就一直画单菌落吧
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mybioon[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的，kan抗性，仅供参考：
我自己做农杆菌AGL1的感受态
做转化，
加质粒，冰浴30min，液氮速冻1min，在37摄氏度水浴 3min，再冰浴1.5min，
加无抗生素的0.5mL LB 100 r/min孵育3h，
最后离心，留150微升悬液涂布于含kan的LB平板。
28摄氏度培养，
培养2d，(培养24h没有长出单菌落）
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quiqui008[使用道具]
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 小中大
请问你的问题找到原因了吗？我最近叶遇到这个问题，农杆菌涂在含氨苄和利福平的板子上，第二天就长满菌，看不到单菌落，各种原因都排查，没找到原因
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